TLR7激動(dòng)劑Loxoribine抑制腫瘤生長的免疫學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、目的：腫瘤局部存在多種類型的免疫抑制性細(xì)胞，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Tregs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Tregs在不同腫瘤中的表達(dá)都有不同程度的增高，諸如肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、淋巴瘤等均發(fā)現(xiàn)有這群細(xì)胞的存在，腫瘤局部Tregs的數(shù)量與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。Tregs通過多種機(jī)制誘導(dǎo)免疫抑制效應(yīng)，是腫瘤免疫逃逸的重要調(diào)控因素，因此抑制Tregs的免疫抑制效應(yīng)是免疫治療的關(guān)鍵步驟。本課題

2、通過CT26小鼠結(jié)腸癌和LLC Lewis小鼠肺癌模型，探討了TLR7受體的激動(dòng)劑Loxoribine抑制腫瘤生長的免疫學(xué)機(jī)制。
　　方法：1）通過CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞和LLC lewis小鼠肺癌細(xì)胞構(gòu)建荷瘤小鼠模型，模型構(gòu)建成功后，以每只荷瘤小鼠1umol的Loxoribine進(jìn)行腹腔注射，對照組注射PBS（9.8％DMSO），隔3天注射1次，持續(xù)3周。觀察Loxoribine對小鼠體內(nèi)腫瘤生長的影響。2）通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(C

3、CK8)檢測Loxoribine對CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞和LLC Lewis小鼠肺癌細(xì)胞是否有直接殺傷作用。3）通過RT-PCR檢測TLR7在CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞和LLC Lewis小鼠肺癌細(xì)胞中是否表達(dá)。4）SCID小鼠是一種缺乏T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的免疫缺陷小鼠，但先天免疫完整。為了明確Loxoribine是否通過激活先天免疫發(fā)揮抑制腫瘤的作用，進(jìn)一步構(gòu)建CT26小鼠結(jié)腸癌和LLC Lewis小鼠肺癌的SCID小鼠荷瘤模型，然后

4、分別以Loxoribine和PBS（9.8%DMSO）進(jìn)行腹腔注射，隔3天注射1次，持續(xù)3周。觀察Loxoribine是否抑制體內(nèi)腫瘤的生長，以明確Loxoribine是否通過激活先天免疫發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。5）通過磁珠分選（MACS）的方法分選出CT26小鼠結(jié)腸癌荷瘤小鼠、LLC Lewis小鼠肺癌荷瘤小鼠以及對照小鼠脾臟、骨髓中CD4+T細(xì)胞，DCs和Tregs，通過淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測Loxoribine處理后對淋巴細(xì)胞增殖的

5、影響。6）通過MACS分選TLR7基因敲除小鼠（TLR7-/-)和對照組小鼠脾臟、骨髓中CD4+T細(xì)胞，DCs和Tregs，經(jīng)Loxoribine刺激后檢測其對淋巴細(xì)胞增殖的影響。7）通過流式細(xì)胞術(shù)檢測Loxoribine對DCs成熟的影響。8）建立Transwell共培養(yǎng)體系（上層加入Tregs，下層加入DCs），在共培養(yǎng)體系中加入Loxoribine觀察其對DCs細(xì)胞因子分泌的影響。9）使用ELISA方法對Loxoribine處理后

6、的DCs進(jìn)行細(xì)胞因子分泌量的檢測并使用相應(yīng)細(xì)胞因子的中和抗體進(jìn)行中和，驗(yàn)證該細(xì)胞因子的作用。將Loxoribine處理后的DCs對小鼠靜脈注射，觀察其對小鼠腫瘤生長的抑制作用。
　　結(jié)果：1）通過CT26小鼠結(jié)腸癌和LLC Lewis小鼠肺癌荷瘤模型發(fā)現(xiàn)，與PBS(9.8%DMSO)注射組相比，Loxoribine注射組小鼠皮下腫瘤生長顯著緩慢，表明Loxoribine能夠抑制腫瘤的體內(nèi)生長。2）RT-PCR結(jié)果顯示，CT26小鼠

7、結(jié)腸癌細(xì)胞和LLC Lewis小鼠肺癌細(xì)胞中均不表達(dá)TLR7。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK8）發(fā)現(xiàn)，Loxoribine對CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞和LLC Lewis小鼠肺癌細(xì)胞無直接殺傷作用。3）通過SCID免疫缺陷小鼠荷瘤模型發(fā)現(xiàn)，Loxoribine處理組和對照組小鼠體內(nèi)腫瘤生長無顯著性差別，表明Loxoribine并不是通過激活先天性免疫而發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。4）通過MACS分選荷瘤組和對照組小鼠體內(nèi)CD4+T細(xì)胞，DCs和Tre

8、gs，淋巴細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未經(jīng)Loxoribine處理的荷瘤小鼠和對照組小鼠相比，使用Loxoribine處理后的荷瘤小鼠體內(nèi)Tregs不能抑制CD4+T細(xì)胞的增殖。5）淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CD4+T細(xì)胞，Tregs或DCs單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，Loxoribine對其增殖沒有直接影響；然而當(dāng)CD4+T/DCs或Tregs/DCs混合培養(yǎng)，Loxoribine可以明顯促進(jìn)CD4+T細(xì)胞或Tregs的增殖，而對CD4+T/Tregs混合

9、培養(yǎng)組細(xì)胞的增殖沒有影響，表明TLR7的激動(dòng)劑Loxoribine通過DCs促進(jìn)CD4+T細(xì)胞和Tregs增殖。6）在CD4+T/DCs/Tregs的培養(yǎng)體系中加入Loxoribine發(fā)現(xiàn)，Loxoribine逆轉(zhuǎn)Tregs對CD4+T細(xì)胞的抑制作用，而這一作用是通過DCs介導(dǎo)的。7）分選野生型和TLR7基因敲除小鼠體內(nèi)CD4+T細(xì)胞、DCs和Tregs，通過淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TLR7在DCs中的表達(dá)是Loxoribine促進(jìn)CD4

10、+T細(xì)胞增殖和逆轉(zhuǎn)Tregs免疫抑制功能所必需的。8）流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示Loxoribine對DCs上CD80、CD86等分子表達(dá)沒有影響，表明Loxoribine不能誘導(dǎo)DCs的成熟。8）ELISA結(jié)果顯示，Loxoribine可以促進(jìn)DCs分泌多種細(xì)胞因子，其中IL-6表達(dá)變化最為明顯，中和IL-6表達(dá)后可以顯著抑制Loxoribine對CD4+T細(xì)胞和Tregs的作用，表明DCs通過分泌IL-6調(diào)控Tregs。9）將Loxor