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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
瘧疾是由瘧原蟲(chóng)感染引起的、通過(guò)媒介雌性按蚊傳播的一種嚴(yán)重危害人類健康的感染性疾病。僅2015年,全球就有約2.14億瘧疾患者,其中43.8萬(wàn)人死亡。瘧疾流行的顯著特征之一是普遍存在反復(fù)感染現(xiàn)象,究其原因在于人體不能建立并維持有效的免疫記憶。CD4+T細(xì)胞不同亞群的活化可顯著影響瘧原蟲(chóng)感染免疫記憶的建立與維持,但這種效應(yīng)取決于樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic Cell,DC)介導(dǎo)CD4+T細(xì)胞不同亞群發(fā)生應(yīng)答的時(shí)相和強(qiáng)度。
2、不同DC細(xì)胞亞群可分別誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向不同的輔助性T細(xì)胞(T helper cell,Th)亞群方向分化。瘧疾感染過(guò)程中,TLR4和TLR9是介導(dǎo)DC活化的主要模式識(shí)別受體,其表達(dá)水平或功能狀態(tài)可能直接影響DC對(duì)CD4+T細(xì)胞不同亞群應(yīng)答模式的調(diào)控,進(jìn)而影響瘧疾的免疫記憶。
研究表明,TLR4可識(shí)別革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖(LPS)、熱休克蛋白(HSP60和HSP70)以及酵母甘露聚糖等,繼而引發(fā)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),刺
3、激不同細(xì)胞的增殖。TLR9主要表達(dá)于漿樣樹(shù)突狀細(xì)胞(pDCs),其激活能夠活化DC,上調(diào)細(xì)胞表面分子如共刺激分子和MHCⅡ類分子的表達(dá),同時(shí)抑制DC的凋亡。
采用TLR4和TLR9激動(dòng)劑,進(jìn)一步確定DC調(diào)控Th細(xì)胞增殖和分化機(jī)制,并通過(guò)非致死型瘧原蟲(chóng)感染模型檢測(cè)TLR4和TLR9激動(dòng)劑對(duì)瘧疾免疫記憶發(fā)生和應(yīng)答的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立約氏瘧原蟲(chóng)感染BALB/c小鼠模型,觀察瘧疾感染早期CD4+T細(xì)胞亞群的活化狀態(tài)、應(yīng)答模式以及感染
4、后期抗體的產(chǎn)生水平以及記憶性T、B細(xì)胞的增殖情況,明確TLRs介導(dǎo)DC調(diào)控免疫記憶建立和維持的作用機(jī)制,以期為研制開(kāi)發(fā)有效的瘧疾疫苗提供新的靶點(diǎn)和思路。
方法:
一、實(shí)驗(yàn)小鼠、瘧原蟲(chóng)
1、實(shí)驗(yàn)小鼠:6~8周齡,SPF級(jí)BALB/c小鼠。
2、約氏瘧原蟲(chóng)Py17XL及Py17XNL寄生的紅細(xì)胞。
二、實(shí)驗(yàn)方法
1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、處理及感染
早期感染模型:感染約氏瘧原蟲(chóng)P
5、y17XL
免疫記憶模型:感染非致死型約氏瘧原蟲(chóng)Py17XNL
(1)LPS處理組:感染前1天(d)腹腔注射TLR4激動(dòng)劑LPS,10μg/只。
(2)CpG1826處理組:感染前1d腹腔注射TLR9激動(dòng)劑CpG1826,50μ g/只。
2、脾細(xì)胞制備及培養(yǎng)
小鼠于感染后0d、3d、5d及16d無(wú)菌摘取脾臟,常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液。用含10%FCS-RPM11640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度至1
6、×107/ml,每孔加入500μ1細(xì)胞懸液至24孔培養(yǎng)板中,設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔,37℃培養(yǎng)48h。350×g室溫離心10分鐘(min),收集上清,-80℃保存,待細(xì)胞因子測(cè)定。
3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)
TLR4水平:CDllc+TLR4+DC;
TLR9水平:CDllc+ TLR9+ DC;
Th1型細(xì)胞水平:CD4+ T-bet+ IFN-γ+;
記憶性T細(xì)胞水平:CD4+ CD62L-CD45
7、RB-;
記憶性B細(xì)胞水平:B220+ IgG+;
長(zhǎng)壽、短壽漿細(xì)胞水平:CD44+ B220-CD138+/CD44+ B220+ CD138+;
分泌IgG型漿細(xì)胞水平:IgG+ CD138+;
中樞性、效應(yīng)性記憶T細(xì)胞:CD4+ CD44+ CD62L+/CD4+ CD44+ CD62L-;
4、細(xì)胞因子檢測(cè)
ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ和TNF-α的
8、含量。
5、血清特異性抗體的檢測(cè)
ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中IgG、IgG1及IgG2a的含量。
6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
應(yīng)用GraphPadPrism5.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析,P<0.05表示差異結(jié)果,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
1、與對(duì)照組相比,Py17XL感染前給予LPS的BALB/c小鼠,原蟲(chóng)血癥水平緩慢上升,于10 d~12 d達(dá)峰值,在感染后14d左右開(kāi)始
9、下降。生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。CpG1826處理組原蟲(chóng)血癥水平和生存期同正常感染組相似。
2、P.y17XL感染后,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟中TLR4+ DC、TLR9+ DC表達(dá)量均明顯增高。其中,LPS處理組TLR4+ DC表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,CpG1826處理組同期相比TLR9+ DC表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。
3、P.y17XL感染后第5d,LPS處理組Th1細(xì)胞水平明顯高于對(duì)照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而CpG1826處理
10、組中Th1細(xì)胞與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。
4、在小鼠感染P.y17XL后第3、5d,LPS組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α水平明顯高于對(duì)照組。而CpG1826處理組中IFN-γ和TNF-α水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。
5、P.y17XNL感染后第16d,與對(duì)照組相比,TLR4和TLR9激動(dòng)劑組脾臟中分泌IgG漿細(xì)胞及各組小鼠血清特異性抗體IgG、IgG1和IgG2a的水平無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
6、P.y
11、17XNL感染后16d,與對(duì)照組相比,TLR4激動(dòng)劑處理組小鼠脾細(xì)胞中記憶性T細(xì)胞(主要是效應(yīng)記憶性T細(xì)胞)增殖明顯,而中樞記憶性T細(xì)胞與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TLR9激動(dòng)劑對(duì)記憶性T細(xì)胞無(wú)明顯作用。
7、P.y17XNL感染后16d,TLR4和TLR9激動(dòng)劑處理組小鼠脾細(xì)胞中記憶性B細(xì)胞及長(zhǎng)、短壽漿細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比變化不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
結(jié)論:
1、在P.y17XL感染BALB/c小鼠模型,TL
12、R4激動(dòng)劑LPS可通過(guò)活化DC增強(qiáng)感染早期Th1型保護(hù)性免疫應(yīng)答,從而使感染小鼠原蟲(chóng)血癥水平降低,生存時(shí)間延長(zhǎng)。而TLR9激動(dòng)劑CpG1826也可增強(qiáng)DC的活化,但對(duì)Th1應(yīng)答無(wú)明顯作用。
2、在P.y17XNL感染BALB/c小鼠模型,TLR4激動(dòng)劑LPS可促進(jìn)記憶性T細(xì)胞(主要是效應(yīng)記憶性T細(xì)胞)增殖,但對(duì)記憶性B細(xì)胞無(wú)明顯作用。TLR9激動(dòng)劑CpG1826對(duì)感染小鼠特異性抗體的分泌以及記憶性T、B細(xì)胞產(chǎn)生的作用均不明顯。
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