旋毛形線蟲預(yù)感染對(duì)夏氏瘧原蟲感染BALB-c小鼠免疫應(yīng)答的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　 瘧疾是瘧原蟲通過媒介按蚊傳播的人類最為嚴(yán)重的寄生原蟲感染性疾病，2003年世界衛(wèi)生組織(WHO)已將瘧疾作為優(yōu)先重點(diǎn)防治的感染性疾病。《世界瘧疾報(bào)告2012》公布的最新數(shù)據(jù)顯示，目前全球有2.19億瘧疾病例，2010年因瘧疾死亡的人數(shù)為66萬，104個(gè)國家和地區(qū)有瘧疾流行的報(bào)告。我國也制定了“十二五”期間在中國境內(nèi)消滅瘧疾的宏偉計(jì)劃。因此，抗瘧研究已經(jīng)成為當(dāng)今世界迫切需要解決的重點(diǎn)課題。瘧疾與其他大多數(shù)感染性疾病一

2、樣，需要通過免疫效應(yīng)機(jī)制對(duì)其控制和消除，免疫應(yīng)答的時(shí)效與強(qiáng)度影響宿主感染瘧原蟲的感染模式與結(jié)局。大量的研究數(shù)據(jù)顯示，在瘧疾流行區(qū)，混合感染現(xiàn)象普遍存在，從而影響宿主的感染模式和結(jié)局。較常見的有瘧原蟲與HIV、蠕蟲或結(jié)核分枝桿菌的混合感染。因此，探討瘧疾流行區(qū)病原體之間的相互作用特點(diǎn)，特別是病原體對(duì)瘧疾免疫應(yīng)答的影響及其相關(guān)機(jī)制無疑將為揭示瘧疾流行區(qū)病原體相互作用的細(xì)胞和分子機(jī)制提供新的理論依據(jù)，進(jìn)一步充實(shí)對(duì)瘧疾免疫的認(rèn)識(shí)。
　　

3、 本研究用旋毛形線蟲小鼠模型再感染瘧原蟲，動(dòng)態(tài)觀察旋毛形線蟲混合感染對(duì)瘧疾感染進(jìn)程與最終結(jié)果的影響，并著重探討T細(xì)胞在感染過程中的變化以及這些變化對(duì)宿主免疫力和預(yù)后的影響，旨在進(jìn)一步揭示旋毛形線蟲與瘧原蟲共同感染的相關(guān)細(xì)胞和分子機(jī)制，以期為瘧疾流行區(qū)新的防控策略的確定提供新的思路。
　　 方法:
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其模型建立
　　 54只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組18只。實(shí)驗(yàn)組小鼠(TPC)經(jīng)口感染

4、300只旋毛形線蟲，并于感染后的1w(TPC1)、3w(TPC3)經(jīng)腹腔感染1×106夏氏瘧原蟲寄生的紅細(xì)胞，構(gòu)建混合感染模型。對(duì)照組(PC)在同一時(shí)間點(diǎn)單純感染夏氏瘧原蟲。
　　 2、原蟲血癥檢測及體重觀察
　　 混合感染模型制備成功后，每天隨機(jī)取3只小鼠，經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，顯徼鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率并記錄小鼠體重變化。
　　 3、脾細(xì)胞熒光抗體染色
　　 無菌取出感染前(0d)

5、和感染后5d、10d、15d小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解紅細(xì)胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/ml。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1mL，每份樣品加入抗-CD4-FITC單抗進(jìn)行表面染色，另設(shè)陰性對(duì)照管。固定透膜后，用抗-IFN-γ-PE單抗、抗-Gata-3-PE單抗進(jìn)行胞內(nèi)染色。用含1％FCS的PBS洗

6、滌兩次并懸浮于500μl PBS中，流式細(xì)胞儀(BectonDickinson，USA)進(jìn)行檢測。每份樣品用抗-CD4-FITC和抗-CD25-PE單抗進(jìn)行表面染色，固定透膜后，用抗-Foxp3-APC單抗進(jìn)行胞內(nèi)染色，用含1％FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于500μl PBS中，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
　　 4、IFN-γ、IL-4及IL-10定量檢測
　　 用雙抗體夾心ELISA試劑盒分別檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ\

7、 IL-4及IL-10的分泌水平。操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測定450nm處OD值。結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用SoflMax Pro4.3.1Ls軟件分析，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　 5、血清特異性抗體檢測
　　 于感染前(0d)和感染后5d、10d、15d采集小鼠眼球血于1.5 ml離心管中，收集瘧原蟲并制備抗原包被酶標(biāo)板，100μl/孔，4℃過夜，5％FCS封閉1h，洗滌后加

8、入1∶200稀釋的血清，37℃2h。洗滌后加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶500)100μl/孔，37℃1h，洗滌。然后加入OPD-H2O2底物顯色，15 min，2M H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定波長490nm處的OD值。
　　 6、轉(zhuǎn)錄因子分析
　　 (1) RNA提取及cDNA合成
　　 采用Trizol一步法提取脾細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)測定RNA的含量。用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)

9、錄為cDNA后，置-20℃保存。
　　 (2)引物設(shè)計(jì)
　　 通過Primer5.0在線軟件設(shè)計(jì)Gata-3，T-bet以及GAPDH實(shí)時(shí)定量PCR引物序列。
　　 (3)熒光定量PCR檢測T-bet及Gata-3 mRNA表達(dá)水平
　　 利用SYBR GreenⅡ染料進(jìn)行各基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，反應(yīng)體系20μL，共40個(gè)循環(huán)。為消除樣本處理、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)差異，每個(gè)樣品GAPDH、Gata-3及T-

10、bet基因同時(shí)檢測3次，取平均值。
　　 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，標(biāo)本采用獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)比較分析組內(nèi)和組間均值差異。P小于0.05為差異顯著。
　　 結(jié)果:
　　 1、混合感染模型的鑒定
　　 旋毛形線蟲感染8w后將全部小鼠引頸處死，取一小塊膈肌壓片鏡檢觀察，證實(shí)小鼠均成功感染旋毛形線蟲。
　　 2、原蟲血癥檢測及體重觀察
　　 與PC組

11、相比，TPC1組感染后第3d，小鼠的外周血中出現(xiàn)瘧原蟲感染的紅細(xì)胞。隨后，BALB/c小鼠原蟲血癥迅速上升，至感染后9d達(dá)到峰值后迅速下降，PC組峰值為40.15％，TPC1組為33.4％（峰值降低）。TPC3組于感染后第5d檢測出原蟲血癥，原蟲血癥出現(xiàn)時(shí)間推遲，至感染后13d達(dá)到峰值44.55％（峰值升高），TPC組與PC組均與感染后21d左右自愈。TPC組與PC組相比體重均下降。
　　 3、旋毛形線蟲與鼠瘧原蟲共同感染小鼠脾

12、細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)量檢測
　　 (1) CD4+IFN-γ+T細(xì)胞數(shù)量檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d、10d，PC組小鼠CD4+IFN-γ+T細(xì)胞均出現(xiàn)明顯增加。TPC1組小鼠于感染后第5d，CD4+IFN-γ+T細(xì)胞數(shù)量顯著高于PC組小鼠。然而，TPC3組與PC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (2) CD4+Gata-3+T細(xì)胞數(shù)量檢測
　　 與感染前相比，感染后第10d，PC組小鼠CD4+Gata-3

13、+T細(xì)胞出現(xiàn)明顯增加。TPC3組小鼠于感染后第10d，CD4+Gata-3+T細(xì)胞數(shù)量顯著高于PC組小鼠。然而，TPC1組與PC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (3) CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d、10d，PC組小鼠Treg細(xì)胞出現(xiàn)明顯增加。TPC1組小鼠于感染前及感染后第5d，Treg細(xì)胞數(shù)量顯著低于PC組小鼠。然而，TPC3組與PC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　

14、 4、旋毛形線蟲與鼠瘧原蟲共同感染小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子檢測
　　 (1)IFN-γ水平檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d，PC組小鼠脾細(xì)胞IFN-γ分泌出現(xiàn)明顯增加。TPC1組小鼠于感染后第5d，IFN-γ分泌水平顯著高于PC組小鼠。然而，TPC3組小鼠于感染后第5d，IFN-γ分泌水平顯著低于PC組小鼠。
　　 (2)IL-4水平檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d、10d、15d，PC組

15、小鼠脾細(xì)胞IL-4分泌出現(xiàn)明顯增加。TPC3組小鼠于感染后第5d、10d，IL-4分泌水平顯著高于PC組。然而，TPC1組與PC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (3)IL-10水平檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d、10d、15d，PC組小鼠脾細(xì)胞IL-10分泌出現(xiàn)明顯增加。 TPC1組小鼠于感染后第5d，IL-10分泌水平顯著低于PC組。然而，TPC3組與PC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5、小鼠血清IgG水平檢

16、測
　　 與感染前相比，感染后第10d、15d，PC組小鼠血清中的特異性IgG出現(xiàn)了有意義的升高。 TPC3組小鼠于感染前及感染后第5d，IgG表達(dá)水平顯著高于PC組。然而，TPC1組與PC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 6、旋毛形線蟲與鼠瘧原蟲共同感染小鼠脾細(xì)胞懸液中轉(zhuǎn)錄因子檢測
　　 (1) T-bet水平檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d、15d，PC組小鼠T-bet表達(dá)出現(xiàn)明顯增加。TPC1組小鼠

17、于感染后第5d，T-bet表達(dá)水平顯著高于PC組。然而，TPC3組與PC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (2) Gata-3水平檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d，PC組小鼠Gata-3表達(dá)出現(xiàn)明顯增加。TPC3組小鼠于感染后第5d，Gata-3表達(dá)水平顯著高于PC組。然而，TPC1組與PC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (3) T-bet與Gata-3表達(dá)水平的比值
　　 與感染前相比，PC組小鼠于感染后第

18、5d，T-bet/Gata-3比值達(dá)到峰值，于感染后第10d迅速下降至最低點(diǎn)，隨后于感染后第15d再次升高。TPC1組小鼠T-bet/Gata-3比值顯著高于PC組。然而，TPC3組小鼠T-bet/Gata-3比值顯著低于PC組。
　　 結(jié)論:
　　 1、不同時(shí)相旋毛形線蟲與夏氏瘧原蟲共同感染BALB/c小鼠，其免疫應(yīng)答模式存在差異。
　　 2、不同時(shí)相旋毛形線蟲混合感染改變宿主對(duì)瘧原蟲的抗感染能力，但混合感染并