日本血吸蟲對繼發(fā)感染伯氏瘧原蟲C57BL-6小鼠免疫應答的影響及其機制研究.pdf

1、前言：
　　瘧疾是由瘧原蟲所引發(fā)的感染性疾病，長久以來嚴重影響人類的健康。目前世界上約有3億人感染瘧疾，每年新發(fā)病例約200萬人，兒童的發(fā)病率遠遠高于成人。在非洲地區(qū)，瘧疾是最為常見的引發(fā)死亡的致病因素之一。每年因瘧疾死亡的兒童超過60萬人。感染惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum，P.falciparum）可引發(fā)腦瘧，它是一種致死性的感染性疾病，主要引發(fā)神經系統(tǒng)的改變，癥狀重且死亡率高。因此，當前關于腦瘧的研究

2、是熱點之一。在動物實驗研究中，常用伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei ANKA，P.berghei ANKA)感染C57BL/6小鼠建立實驗性腦瘧模型（Experimental cerebral malaria，ECM），研究證實這種模型與人類腦瘧極為相似，且C57BL/6小鼠對腦瘧具有很強的易感性。在ECM發(fā)病過程中會出現感染紅細胞沉積于腦部毛細血管，并繼而引發(fā)免疫細胞及血小板粘附于腦部血管內皮細胞上，引發(fā)腦部出血和水腫

3、，同時引發(fā)血腦屏障通透性的改變。
　　一般說來，強烈的Th1應答是腦瘧的主要特征，在瘧疾感染早期，樹突狀細胞(Dendritic Cell，DC)在誘導產生獲得性免疫應答中起到了重要作用。成熟的DC是活化初始T細胞的唯一抗原提呈細胞，可啟動并介導初始T細胞向Th1、Th2或Treg等不同亞群分化。體外研究表明，DC可選擇性吞噬瘧原蟲寄生的紅細胞（Parasitized red blood cell，pRBC），加工和提呈瘧原蟲抗原

4、給CD4+T細胞進而誘導保護性Th1細胞免疫應答的建立。這充分提示，作為抗原提呈細胞的DC在瘧疾感染過程中可能發(fā)揮重要作用。前期研究已經證實，在瘧疾感染過程中，DC參與了T細胞介導的免疫應答的建立和調節(jié)。此外，DC分泌的前炎性細胞因子IL-12與免疫調節(jié)性細胞因子IL-10或TGF-β之間處于動態(tài)平衡模式，該平衡的移動可影響Th1細胞免疫應答的啟動和調控。
　　在Th1免疫應答建立之后，由Th2型細胞輔助B細胞產生特異性抗體，能夠

5、有效地清除瘧原蟲，防止復發(fā)。普遍認為，使前炎癥因子和抗炎癥因子保持適當的平衡能夠有效地控制腦瘧的嚴重程度。若缺乏最初的炎癥期則導致原蟲大量增殖;若炎癥應答不能控制在一定程度之下則會導致嚴重的免疫病理損傷。CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)T細胞(Regulatory T cell，Tregs)在調節(jié)這種平衡中起到了關鍵的作用。研究已經證實Tregs通過限制前炎癥免疫應答使BALB/c鼠抵抗腦瘧。研究同樣證實了在伯氏瘧原蟲感染過程中出現的

6、Tregs與產生的IFN-γ呈負相關。誘導產生的或活化的Tregs有利于脊椎動物宿主，因為它能夠下調炎癥免疫應答，從而防止產生免疫介導的病理損傷。
　　血吸蟲病是熱帶或亞熱帶地區(qū)另一種常見傳染性疾病之一，其發(fā)病率僅低于瘧疾。常見有三種血吸蟲種屬感染人類:曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni,S.mansoni)、埃及血吸蟲（Schistosoma haematobium，S.haematobium）以及日本血吸蟲（S

7、chistosoma japonicum，S.japonicum）。最近有研究表明，蠕蟲感染可減低機體內的前炎癥因子的水平，從而可對蠕蟲與其它寄生蟲的混合感染產生影響。由于蠕蟲與瘧原蟲在很多區(qū)域同時流行，因此常可觀察到血吸蟲病和瘧疾共同感染的現象。目前關于蠕蟲與瘧疾混合感染的研究已有很多，但研究所得出的結果大多互相矛盾。有研究表明曼氏血吸蟲感染會導致惡性瘧原蟲感染率的增高，而其它研究卻發(fā)現埃及血吸蟲感染會降低繼發(fā)瘧疾感染中原蟲血癥的蟲荷

8、、降低瘧疾的發(fā)病率，從而證明埃及血吸蟲感染對瘧疾起到一定的保護作用。有人認為這些研究所得出的結果之所以相互矛盾可能與研究中所用的蠕蟲種屬不同有關。當前，在研究血吸蟲參與的免疫應答中，曼氏血吸蟲的應用最為常見。目前關于日本血吸蟲與瘧原蟲混合感染的研究尚未見報道。有研究證明，與曼氏血吸蟲感染相比，日本血吸蟲感染會引發(fā)更加嚴重的肝部病變，說明日本血吸蟲感染與曼氏血吸蟲感染可引發(fā)顯著不同的組織病變。
　　本研究利用日本血吸蟲與伯氏瘧原蟲混

9、合感染C57BL/6小鼠，并與伯氏瘧原蟲單獨感染的小鼠進行比較，分析血吸蟲混合感染對ECM的作用及對小鼠感染進程及結局的影響。旨在通過對比分析宿主固有免疫和適應性免疫應答特點，進一步揭示瘧原蟲與血吸蟲共同感染的相關細胞和分子機制，以期為瘧疾流行區(qū)新的防控策略的確立提供理論依據。
　　實驗材料與方法：
　　1、實驗動物及模型構建
　　6～8周齡，雌性C57BL/6小鼠經尾靜脈分別感染100或200條S.japonicum

10、尾蚴，8周后經腹腔分別感染1×106或1×105P.berghei ANKA，分別建立4種感染不同寄生蟲蟲荷/數量的混合感染模型。單獨感染不同蟲荷的P.berghei或S.japonicum及未經感染的小鼠用作對照組。監(jiān)測原蟲血癥水平、生存率及ECM臨床評分指標。
　　2、小鼠腦組織病理學檢查
　　1)取材組織塊，經固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μn切片。
　　2)切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗:二甲苯(Ⅰ)5min

11、→二甲苯(Ⅱ)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸餾水洗2min。
　　3)蘇木素染色5min，自來水沖洗。
　　4)鹽酸乙醇分化30s（提插數下）。
　　5)自來水浸泡15min或溫水（約50℃）5min。
　　6)置伊紅液2min。
　　常規(guī)脫水，透明，封片:95％乙醇(Ⅰ)min→95％乙醇(Ⅱ)1min→100％乙醇(Ⅰ)1min→100％

12、乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3∶1)1min→二甲苯(Ⅰ)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性樹脂封固。
　　3、小鼠血腦屏障通透性檢測
　　1)將各組小鼠尾靜脈注射200μl2％伊文思藍染料。
　　2)1h后，心臟灌注生理鹽水而至流出清亮液體為準，然后取腦，拍照。
　　3)將各組小鼠的腦組織放入離心管中，管內加入1ml甲酰胺，37℃孵育48h。
　　4)將各管取出，3000rpm離心15min，取上

13、清液200μl，放于96孔板中。630nm檢測OD值。
　　4、Real-time RT-PCR檢測腦組織中相關因子mRNA的相對表達
　　腦組織Total RNA的提取及反轉錄:用Trizol按照說明書提取腦組織RNA，然后使用分光光度計測定濃度。用PrimeScriptTMRT試劑盒（Takara公司）去除基因組DNA，將RNA反轉錄成cDNA。反轉錄體系為20μl，含有PrimeScriptTM緩沖液，PrimeScr

14、iptTMRT酶混合物，oligodT引物（50μM）和隨機引物兩種（100μM）及500ng總RNA。Real-time反應:用得到的cDNA作為模板和特定引物進行PCR反應。使用SYBR(@)PremixExTaqTM試劑盒進行定量PCR。反應條件如下:95℃預變性30秒，40個PCR循環(huán)（95℃5秒和60℃30秒）。采用2-△△CT法量化各組之間的相對基因表達。
　　5、腦組織中CD4+/CD8+T細胞檢測
　　取腦組

15、織，150目篩網研磨腦，并分離單個核細胞。將組織置入5mlRPMI1640（含100U/mlⅣ型膠原酶）中獲取單細胞懸液，42℃培育45分鐘。30％Percoll中重懸。300g離心10min，收集細胞沉淀，用30％Percoll重懸沉淀，然后加入到70％Percoll上層（用PBS配制），515g室溫離心30min。收集中間層，加入10mlPBS300g離心10min，標記如下抗體:FITC-anti-CD4，PerCP-Cy5.5-

16、anti-CD8(clone53-6.7)，orAPC-anti-CD3(clone145-2C11)。4℃染色30分鐘。PBS洗滌2遍。用2％多聚甲醛固定，流式細胞儀進行檢測。利用FlowJo軟件分析數據。
　　6、脾細胞熒光抗體染色
　　無菌取出感染后第1d、3d、5d及8d小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細胞懸液，用0.17mol/LNH4C1裂解紅細胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640調整脾細胞終濃度為1×10

17、7/ml。
　　①在預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1ml，再加入抗-CD11c-FITC單克隆抗體、抗-CD11b-PE單克隆抗體和抗-CD45R/B220-PerCP單克隆抗體進行表面染色。離心去上清后，用0.5ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。
　　②在預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1ml，再加入抗-CD11c-FITC單克隆

18、抗體、抗-MHCⅡ-PE單克隆抗體和抗-CD86-PE單克隆抗體。離心去上清后，用0.5ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。
　?、墼陬A先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1ml，再加入抗-CD11c-FITC和抗-TLR4-PE單抗。離心去上清后，用0.5ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。
　　④在預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸

19、液0.1ml，按試劑說明書所示，進行固定和透膜后，再分別加入生物素標記的抗-TLR9單抗和PE-streptavidin。離心去上清后，用0.5ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。
　?、菰陬A先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1ml，用抗CD4-FITC和抗CD25-PE單抗進行表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-APC單抗進行胞內染色，用含1％FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于0.5

20、mlPBS中，流式細胞儀進行檢測。
　?、奕〔糠謽悠?7℃條件下加入ConA刺激2小時后加入Golgi Stop共同培養(yǎng)4小時，用含1％FCS的PBS洗滌后，加入抗-CD4-FITC、抗-CD25-PE單抗進行雙色分析，另設陰性對照管。按試劑說明書所示，進行固定和透膜后，加入抗-Foxp3-APC及抗-PerCP-IL-10。用含1％FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于500μlPBS中，流式細胞儀進行檢測。
　?、呷〔糠謽悠?7

21、℃條件下加入ConA刺激2小時后加入Golgi Stop共同培養(yǎng)4小時，用含1％FCS的PBS洗滌后，加入抗-CD4-FITC、抗-CD25-PE單抗進行雙色分析，另設陰性對照管。按試劑說明書所示，進行固定和透膜后，加入抗-Foxp3-APC及抗-PerCP-IFN-γ。用含1％FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于500μlPBS中，流式細胞儀進行檢測。
　　7、脾細胞上清細胞因子定量檢測
　　用ELISA試劑盒分別檢測脾細胞培養(yǎng)

22、上清中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-10及TGF-β的分泌水平。酶標儀測定450nm處OD值。實驗操作按照試劑盒說明書進行，結果以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線，應用SoftMaxPro4.3.1Ls軟件分析，計算細胞因子含量(pg/ml)。
　　8、統(tǒng)計學分析
　　使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數據進行分析，數據用均數±標準差表示。生存率的比較采用Log-rank(Mantel-Cox)檢驗。多個樣本之

23、間的比較采用方差分析。方差齊采用Bonferroni檢驗;方差不齊采用Tamhane's T2檢驗。P＜0.05為具有統(tǒng)計學差異。
　　實驗結果：
　　1、混合感染與伯氏瘧原蟲單獨感染小鼠的原蟲血癥水平、生存率及ECM臨床評分
　　從感染開始，各組中的小鼠原蟲血癥的水平整體呈上升趨勢。不論感染高蟲荷(106)還是低蟲荷(105)的P.berghei，混合感染鼠中的原蟲血癥水平均較單獨感染鼠增高，且與尾蚴感染的數量呈正相

24、關。感染P.berghei后的第6-8天是ECM的發(fā)病期，在此期間，大量的小鼠表現出腦瘧的臨床癥狀并死亡。混合感染組中小鼠的生存率高于P.berghei單獨感染小鼠。在感染低蟲荷P.berghei時，混合感染時增加感染尾蚴的數量可提高小鼠的生存率;而在感染高蟲荷P.berghei時，增加感染尾蚴的數量不能顯著提高小鼠的生存率?；旌细腥拘∈蟮呐R床評分顯著低于P.berghei單獨感染小鼠。在感染低蟲荷P.berghei時，混合感染時增加感

25、染尾蚴的數量可顯著減低ECM臨床評分;而在感染高蟲荷P.berghei時，增加感染尾蚴的數量不能顯著降低ECM臨床評分。
　　2、混合感染對腦組織病理學的改變
　　P.berghei感染后第6-8天腦組織病理學檢查發(fā)現，單獨感染組小鼠腦部出現單個核細胞聚集，混合感染小鼠腦部病變較單獨感染輕微，在增加感染尾蚴數量時，部分小鼠腦部無明顯病變。
　　3、混合感染對ECM中BBB通透性的影響
　　于感染后第6天檢測各組小

26、鼠BBB通透性。P.berghei單獨感染時，腦組織血管的通透性顯著增高，混合感染時可降低BBB通透性。利用比色分析法進行定量分析表明，混合感染組中Evansblue/brain tissue比值顯著低于單獨感染組。當感染低蟲荷P.berghei時，混合感染時增加尾蚴的數量可顯著降低該比值;反之，當感染高蟲荷P.berghei時，增加感染尾蚴的數量不能明顯降低該比值。
　　4、混合感染對腦組織中CD4+/CD8+T細胞遷移的影響<

27、br>　　混合感染可顯著降低CD8+T細胞的比例。在感染低蟲荷P.berghei時，混合感染時增加感染的尾蚴劑量可顯著降低CD8+T細胞的比例;反之，感染高蟲荷P.berghei時，混合感染時增加感染的尾蚴劑量不能明顯降低CD8+T細胞的比例。
　　5、混合感染對腦組織中相關細胞因子、趨化因子及粘附分子的相對mRNA表達的影響
　　通過Real-time RT-PCR方法檢測了腦組織中與ECM發(fā)生密切相關的IFN-γ、TNF

28、-α及粘附分子ICAM-1和趨化因子CXCL9、CXCL10基因的mRNA相對表達水平。結果顯示混合感染可顯著降低以上因子的mRNA表達水平。在感染低蟲荷P.berghei時，混合感染時增加感染尾蚴的數量可進一步抑制上述因子的表達水平;反之，在感染高蟲荷P.berghei時，混合感染時增加感染尾蚴的數量不能進一步抑制上述因子的表達水平。
　　6、混合感染對小鼠脾細胞DC亞群的影響
　　所有組別中的小鼠DC亞群在感染P.ber

29、ghei后數量開始增加，在感染第5天后達到峰值。此外，混合感染可顯著降低DC亞群的數量。為了評價感染寄生蟲的蟲荷或數量改變對混合感染的影響，我們分別采用了兩種蟲荷的瘧原蟲和兩種數量的血吸蟲分別進行混合感染。結果表明，在感染低蟲荷P.berghei時，增加混合感染的血吸蟲尾蚴數量可進一步降低DC亞群的數量;反之，在感染高蟲荷的P.berghei時，增加混合感染的血吸蟲尾蚴數量不能顯著降低DC亞群的數量。
　　7、混合感染對小鼠脾細胞

30、DC分子表達的影響
　　在感染P.berghei后，所有組別中的小鼠CD11c+MHCⅡ+/CD11c+CD86+數量均開始增加，在感染后第5天達到高峰。此外，混合感染可顯著降低上述分子的表達。在感染低蟲荷P.berghei時，增加混合感染血吸蟲尾蚴的數量可進一步降低該類分子的表達;反之，在感染高蟲荷的P.berghei時，增加混合感染血吸蟲尾蚴的數量不會引起顯著改變。
　　8、血吸蟲混合感染對小鼠脾細胞DC中TLR4/TL

31、R9的影響
　　在感染P.berghei后，所有組別中的小鼠CD11c+TLR4+及CD11c+TLR9+數量均開始增加，在感染后第5天達到高峰。此外，混合感染可顯著降低上述DC的數量。在感染低蟲荷P.berghei時，增加混合感染血吸蟲尾蚴的數量可進一步降低該類DC的數量;反之，在感染高蟲荷的P.berghei時，增加混合感染血吸蟲尾蚴的數量不會引起顯著改變。
　　9、血吸蟲混合感染對小鼠脾細胞Tregs數量的影響

32、　　所有組別中的小鼠Tregs數量在感染P.berghei后開始增加，在感染第5天后達到峰值。此外，混合感染可顯著增加Tregs的數量。為了評價感染寄生蟲的濃度或劑量改變對混合感染的影響，我們分別采用了兩種蟲荷的瘧原蟲和兩種數量的血吸蟲實行混合感染。結果表明，在感染低蟲荷P.berghei時，增加混合感染的血吸蟲尾蚴數量可進一步增加Tregs的數量;反之，在感染高蟲荷的P.berghei時，增加混合感染的血吸蟲尾蚴數量不能引起顯著改變。

33、
　　10、混合感染對小鼠脾細胞IL-10分泌型Tregs的影響
　　我們檢測了在相應時間點上不同組別的小鼠IL-10分泌型Tregs數量有無變化。結果顯示混合感染不能改變其水平。在改變感染寄生蟲的蟲荷或數量時，此指標亦無明顯改變。
　　11、混合感染對小鼠脾細胞IFN-γ分泌型Tregs的影響
　　所有組別中的小鼠IFN-γ分泌型Tregs的數量在感染P.berghei后開始增加，在感染第5天后達到峰值。此外，

34、混合感染可顯著減少IFN-γ分泌型Tregs的數量。為了評價感染寄生蟲的蟲荷或數量改變對混合感染的影響，我們分別采用了兩種蟲荷的瘧原蟲和兩種數量的血吸蟲分別實行混合感染。結果表明，在感染低蟲荷P.berghei時，增加混合感染的血吸蟲尾蚴數量可進一步減少IFN-γ分泌型Tregs的數量;反之，在感染高蟲荷的P.berghei時，增加混合感染的血吸蟲尾蚴數量不能引起顯著改變。
　　12、細胞因子水平的檢測
　　為了評價混合感染

35、中前炎癥因子（INF-γ）與抗炎癥因子(IL-4，IL-5，IL-13)的關系，同時為了評價參與調節(jié)應答的細胞因子(IL-10，TGF-β)的變化，我們對小鼠脾細胞上清的相關細胞因子進行了檢測。結果發(fā)現，各組小鼠在感染P.berghei后，上述細胞因子的水平均開始增加并在第5天達到峰值。此外，混合感染可顯著增高IL-4，IL-5，IL-13及TGF-β的水平，并顯著降低前炎癥因子INF-γ的水平，而IL-10的水平無明顯變化。為了評價感

36、染寄生蟲的蟲荷或數量改變對混合感染的影響，我們采用了兩種蟲荷的瘧原蟲和兩種數量的血吸蟲分別實行混合感染。結果表明，在感染低蟲荷P.berghei時，增加混合感染的血吸蟲尾蚴數量可進一步增加IL-4，IL-5，IL-13及TGF-β的水平并進一步減少INF-γ的水平;反之，在感染高蟲荷的P.berghei時，增加混合感染的血吸蟲尾蚴數量不能引起顯著改變。
　　結論：
　　1、血吸蟲混合感染可降低ECM死亡率及臨床評分。感染低濃

37、度P.berghei時，增加混合感染的血吸蟲尾蚴數量能進一步降低ECM死亡率及臨床評分。
　　2、血吸蟲混合感染降低了腦組織中CD8+T細胞的遷移，減低了BBB的通透性，降低了腦組織中與ECM相關的前炎癥因子、趨化因子及粘附分子的mRNA表達。改變混合感染的兩種寄生蟲的蟲荷/數量可引發(fā)相應改變，與ECM生存率的變化一致。
　　3、血吸蟲混合感染可抑制脾細胞中的DC應答，減低DC亞群數量，抑制DC成熟及Toll樣受體的表達。改