血脂紊亂對C57BL-6小鼠外周神經(jīng)病變的影響及其可能機制.pdf

1、[背景]
　　 目前，糖尿病的患病率急劇上升。依據(jù)不同的診斷標準，至少50％～90％的糖尿病患者將會發(fā)生糖尿病神經(jīng)病變。糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，其最常見的形式是遠端對稱性多神經(jīng)病變，多從下肢開始，由遠端到近端，對稱性地發(fā)生神經(jīng)功能的缺失，呈現(xiàn)手套、襪套樣分布。有統(tǒng)計顯示，糖尿病確診后的25年內發(fā)生下肢截肢的累積風險率為22％，人群中

2、60％的下肢截肢是由糖尿病神經(jīng)病變所致，每年花費超過220億美元，患者的生活質量顯著下降。糖尿病周圍神經(jīng)病變不僅危害人類健康，也對整個社會造成了巨大的經(jīng)濟負擔。因此，預防和治療糖尿病周圍神經(jīng)病變是一項重要和急迫的公共衛(wèi)生問題，需要更深入地研究其發(fā)病機制。
　　 高血糖是糖尿病神經(jīng)病變發(fā)展的驅動力，通過誘導系統(tǒng)和神經(jīng)的氧化應激明確的導致外周神經(jīng)損傷。良好的血糖控制可以減少糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病率，但資料顯示單單控制血糖并不能有效

3、阻止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。越來越多的研究顯示出血脂異常在糖尿病神經(jīng)病變發(fā)生和發(fā)展中的重要作用。這可能解釋2型糖尿病患者相對于1型糖尿病患者更早地發(fā)生神經(jīng)病變。血脂異常常出現(xiàn)在2型糖尿病早期，并與糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生相關;而1型糖尿病患者在初診糖尿病時血脂水平一般正常，而在病程后期往往會出現(xiàn)血脂異異常，并且這異常的血脂水平與糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生和發(fā)展的延遲是一致的。一些針對2型糖尿病患者的大型臨床研究也指出早期的血脂異常是發(fā)生糖尿病神經(jīng)病變

4、主要的獨立危險因素。
　　 由于發(fā)病機制復雜，糖尿病周圍神經(jīng)病變的病因尚未闡明，仍缺乏有效的治療手段。但臨床和基礎研究逐漸達成共識，氧化應激是糖尿病微血管并發(fā)癥包括糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病基礎。對于1型糖尿病患者，微血管病變的嚴重程度平行于系統(tǒng)氧化應激的程度，隨著疾病的進展，抗氧化能力下降而脂質過氧化產(chǎn)物增加。對于2型糖尿病患者也有類似的氧化應激表現(xiàn)，并與微血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展相關。增強的氧化應激存在于外周神經(jīng)，足背和交感神經(jīng)

5、節(jié)以及外周神經(jīng)系統(tǒng)的脈管系統(tǒng)，并涉及神經(jīng)血管功能障礙，運動和感覺神經(jīng)傳導速度缺陷，神經(jīng)營養(yǎng)支持受損，神經(jīng)代謝和信號傳導改變以及糖尿病特征性的形態(tài)學異常。
　　 12/15-脂加氧酶(12/15-lipoxygenase，12/15-LOX)是細胞內非血紅素加雙氧酶，它氧化脂蛋白和磷脂中酯化了的花生四烯酸形成具有生物學活性的類二十烷酸。12/15-脂加氧酶上調導致細胞信號傳導受損，氧化-硝化應激和炎癥反應。近年來研究認為該酶與糖尿

6、病神經(jīng)病變有關。Stavriichuk等發(fā)現(xiàn)12/15-脂加氧酶過表達和激活導致外周神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)硝化應激，并促進糖尿病前期和糖尿病相關的神經(jīng)病變的發(fā)展。有研究證實12/15-脂加氧酶與運動和感覺神經(jīng)傳導速度減慢，小的感覺神經(jīng)纖維功能障礙和DPN特征性的大的有髓神經(jīng)纖維的軸突萎縮相關。
　　 越來越多的臨床研究證實血脂異常與DPN的發(fā)展相關聯(lián)，但尚需進一步的基礎研究支持。本研究探討高脂飲食誘導血脂紊亂的小鼠外周神經(jīng)功能的改變及其可

7、能機制，為早期DPN的預防和治療提供新的思路。通過測定熱痛覺閾值和神經(jīng)傳導速度評估高脂飲食誘導血脂紊亂的C57BL/6小鼠外周神經(jīng)功能的改變。此外，通過觀察血清氧化應激指標丙二醛(malondialdehyde，MDA)和總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)以及坐骨神經(jīng)12/15-脂加氧酶表達的改變探討血脂紊亂對C57BL/6小鼠發(fā)生外周神經(jīng)病變的可能作用機制。
　　 第一章血脂紊

8、亂對C57BL/6小鼠外周神經(jīng)病變的影響
　　 [目的]
　　 觀察高脂飲食誘導血脂紊亂的C57BL/6小鼠外周神經(jīng)功能的改變。
　　 [方法]
　　 1、3周齡的C57BL/6小鼠隨機分為正常飲食組和高脂飲食組，每組10只小鼠，自由進水。
　　 2、觀察小鼠一般情況，并每周定期稱重，記錄體重變化。
　　 3、自分組喂養(yǎng)第6周起，隔周行腹腔內葡萄糖耐量實驗?？崭?小時后，采集鼠尾一滴血并用

9、標準血糖儀測定空腹血糖值。小鼠清醒狀態(tài)下按1g/kg體重腹腔內注入葡萄糖，測定注入后第30，60和120分鐘的血糖值。以血糖曲線下面積表示糖耐量。計算血糖曲線下面積(area under the curve，AUC)，以超過正常對照組小鼠AUC的-x±3s為診斷糖尿病的標準。
　　 4、當高脂飲食組小鼠出現(xiàn)糖耐量異常時行外周神經(jīng)功能學檢測。將小鼠放在（55±0.5℃）恒溫電熱板上，以小鼠足底接觸熱板至出現(xiàn)舔后趾的平均反應時間作為

10、熱痛覺閾值來評估小鼠對熱有害刺激的敏感性。每只小鼠重復測定4次取平均值，每次測定至少間隔10分鐘。
　　 5、聯(lián)合氯胺酮(100mg/kg)和乙酰丙嗪(10mg/kg)腹腔內注射麻醉小鼠，并使其體溫維持在32-34℃。采用澳洲AD公司powerlab/8s多用生理記錄儀測定。運動神經(jīng)傳導速度(MNCV)=兩刺激電極與記錄電極之間傳導距離之差/兩刺激電極與記錄電極之間傳導潛伏期之差，感覺神經(jīng)傳導速度(SNCV)=刺激電極與記錄電極

11、之間距離/潛伏期。每只小鼠重復測定3次取平均值，每次測定至少間隔15分鐘。
　　 6、過量戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠。EP管收集血標本，4℃下1500轉/分離心15分鐘，分離血清，-80℃保存待檢。應用全自動生化分析儀測定甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low den

12、sity lipoprotein，LDL-C)。
　　 7、實驗數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 [結果]
　　 1、分組喂養(yǎng)14周后，高脂飲食組小鼠體重較正常對照組升高29.09％(t=-5.804，P=0.000)，而兩組隨機血糖無顯著性差異(t=-2.055，P=0.055)。
　

13、　 2、第14周時，高脂飲食組小鼠腹腔內注射葡萄糖后第30min和60min血糖濃度均高于正常組(t=-3.844，P＜0.001;t=-2.511，P=0.022)，而兩組空腹血糖及第120min血糖濃度并無顯著性差異(t=-1.989，P=0.062; t=-2.023，P=0.058)。計算血糖曲線下面積，高脂飲食組小鼠出現(xiàn)糖耐量異常(t=-3.625，P=0.002)。
　　 3、在熱板試驗中，與正常對照組相比，高脂飲

14、食組小鼠對熱有害刺激反應的潛伏期明顯縮短(t=2.313，P=0.033)。
　　 4、與正常對照組相比，高脂飲食組小鼠運動和感覺神經(jīng)傳導速度明顯減慢(t=2.430,P=0.026;t=2.527,P=0.021)。
　　 5、血清TC、HDL-C、LDL-C分別較正常對照組升高86.99％、38.0％、85.42％(t=-12.676，P=0.000; t=-8.061，P=0.000; t=-12.794，P=0.

15、000)，而TG無顯著性差異(t=-1.502，P=0.151)。
　　 [結論]
　　 1、高脂飲食誘導C57BL/6小鼠成功構建血脂紊亂動物模型。
　　 2、血脂紊亂的C57BL/6小鼠在尚未出現(xiàn)糖尿病的階段已經(jīng)出現(xiàn)了外周神經(jīng)功能的改變，類似于人類糖尿病前期或肥胖階段外周神經(jīng)病變的特點，提示血脂紊亂可能是糖尿病周圍神經(jīng)病變的風險因素，早期行降脂治療可能有助于阻止或延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)展。
　　

16、第二章血脂紊亂的C57BL/6小鼠發(fā)生外周神經(jīng)病變的機制初探
　　 [目的]
　　 觀察血清氧化應激指標和坐骨神經(jīng)12/15-脂加氧酶表達的改變，探討血脂紊亂的C57BL/6小鼠發(fā)生外周神經(jīng)病變的可能機制。
　　 [方法]
　　 1、血清T-SOD和MDA測定分別采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法。
　　 2、迅速分離坐骨神經(jīng)，液氮中冰凍，-80℃保存待檢。應用蛋白免疫印跡法(western bl

17、ot)檢測12/15-LOX蛋白的表達。
　　 3、實驗數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 [結果]
　　 1、與正常對照組相比，高脂飲食組小鼠血清T-SOD活性和MDA含量均顯著增加(t=-2.278，P=0.035; t=-2.6967，P=0.020)。
　　 2、高脂飲食組小鼠坐

18、骨神經(jīng)12/15-LOX蛋白含量明顯高于正常對照組(t=-8.135，P=0.001)。
　　 [結論]
　　 1、高脂飲食組小鼠體內出現(xiàn)氧化應激，提示氧化損傷可能是導致血脂紊亂的C57BL/6小鼠出現(xiàn)外周神經(jīng)病變的重要因素，從而抗氧化治療在早期糖尿病周圍神經(jīng)病變中的應用可能有積極意義。
　　 2、血脂紊亂的C57BL/6小鼠坐骨神經(jīng)12/15-脂加氧酶過表達和激活，提示該酶可能參與了外周神經(jīng)病變的發(fā)生，因此可能