神經(jīng)肽SP對C57BL-6小鼠脾NK細(xì)胞遷移及趨化因子受體表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　NK細(xì)胞主要存在于肝、脾、肺和外周血。NK細(xì)胞可以利用細(xì)胞因子效能和細(xì)胞毒活性，對機(jī)體炎癥感染和抗腫瘤疾病免疫發(fā)揮關(guān)鍵性作用。NK細(xì)胞可以殺死炎癥性、病原感染性以及腫瘤性細(xì)胞，這是經(jīng)過不同種類的NK細(xì)胞表面受體發(fā)揮作用的。NK細(xì)胞可以表達(dá)不同功能和種類的受體，它們能夠與其密切聯(lián)系的細(xì)胞因子和趨化因子之間發(fā)生聯(lián)系，以此來調(diào)節(jié)其向炎癥感染以及腫瘤病灶等部位聚集、行使趨化能力或者進(jìn)行其它生物學(xué)活動(dòng)。
　　SP是一類神經(jīng)

2、肽物質(zhì)，而神經(jīng)肽是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)受到各種影響或者發(fā)揮作用反應(yīng)時(shí)分泌的一類生物活性肽，其對機(jī)體進(jìn)行各種免疫功能調(diào)節(jié)具有非常重要的調(diào)控作用。SP對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和免疫活動(dòng)都有著很好的促進(jìn)效應(yīng)，是體內(nèi)進(jìn)行自身調(diào)節(jié)和防御機(jī)制必不可少的調(diào)節(jié)性多肽，它對機(jī)體中自然殺傷細(xì)胞的增殖能力和殺傷活性具備了雙向作用功能。自然殺傷細(xì)胞在各種趨化性細(xì)胞因子及其受體影響下，可遷移到病變部位，發(fā)揮抵抗炎癥感染和防御腫瘤侵害的免疫防御作用。通過研究SP對小鼠NK細(xì)胞遷移

3、能力和趨化因子受體表達(dá)功能的影響，為研究SP對NK細(xì)胞作用機(jī)制提供了更多線索，并為抗腫瘤癌變、抗炎癥感染及抗移植排斥等醫(yī)療活動(dòng)提出新的策略。
　　方法：
　　1、C57BL/6小鼠脾臟NK細(xì)胞的提取分離。①實(shí)驗(yàn)用C57BL/6小鼠處死后，獲取脾組織細(xì)胞懸液;②小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離，收集其中的白色懸浮層細(xì)胞;③Miltenyi MACS NK細(xì)胞分選，收集NK細(xì)胞。④測定分離純化的NK細(xì)胞活性⑤NK細(xì)胞純化率流式測定。

4、　　2、C57BL/6小鼠脾NK細(xì)胞吉姆薩染色以及熒光染色。①吉姆薩染色:NK細(xì)胞懸液涂布在載玻片;甲醇固定;吉姆薩液染色;顯微鏡觀察并拍照。②熒光染色:NK細(xì)胞封閉液封閉;NK1.1抗體孵育;熒光顯微鏡觀察拍照。
　　3、C57BL/6小鼠脾NK細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):Transwell法檢測不同濃度SP（終濃度為0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M）對C57BL/6小鼠脾NK細(xì)胞遷移的影響。
　　

5、4、趨化因子受體mRNA表達(dá)的測定:不同濃度SP(終濃度為0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M)處理NK細(xì)胞6小時(shí)，Real-Time PCR檢測各實(shí)驗(yàn)組趨化因子受體CCR5、CCR3、CXCR4的mRNA表達(dá)水平。
　　5、不同濃度SP（終濃度為0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M）處理NK細(xì)胞6小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測C57BL/6小鼠NK細(xì)胞表面趨化因子受體CC

6、R5、CCR3、CXCR4的表達(dá)情況。
　　6、不同濃度SP(終濃度為0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M)處理NK細(xì)胞24小時(shí)，流式方法測定各實(shí)驗(yàn)組NK細(xì)胞亞群變化。
　　結(jié)果：
　　1、C57BL/6小鼠脾NK細(xì)胞陰性分選后NK1.1陽性細(xì)胞率(％):83.00±1.91。
　　2、磁珠分選C57BL/6小鼠脾NK細(xì)胞經(jīng)吉姆薩染色和蘇木素染色:鏡下可見圓形或橢圓形細(xì)胞，細(xì)胞核

7、為橢圓形，有染色的嗜天青顆粒存在。磁珠分選C57BL/6小鼠脾NK細(xì)胞使用NK1.1熒光標(biāo)記，鏡下只見紅色熒光的細(xì)胞。
　　3、在(10-14M～10-10M) SP濃度范圍內(nèi)，隨著SP濃度的增加，其促進(jìn)NK細(xì)胞遷移作用逐漸增強(qiáng)，達(dá)到峰值，其后，在(10-10M～10-6M) SP濃度范圍內(nèi)，隨著SP濃度的增加，其促進(jìn)NK細(xì)胞遷移作用逐漸減弱。
　　4、SP對3種趨化因子受體mRNA表達(dá)的影響不同。①CCR3在SP10-14

8、M、10-12M濃度時(shí)，可明顯促進(jìn)其mRNA表達(dá)。②CCR5在(10-10M～10-6M) SP濃度范圍內(nèi)，可明顯促進(jìn)其mRNA的表達(dá)。③CXCR4在（10-14M～10-6M）SP濃度范圍內(nèi)，其均可明顯促進(jìn)其mRNA的表達(dá)。
　　5、SP對小鼠脾NK細(xì)胞表面趨化因子受體CCR3、CCR5、CXCR4表達(dá)的影響不同。①在(10-14M～10-6M) SP濃度范圍內(nèi)，陽性細(xì)胞表達(dá)逐漸下降。②在（10-14M～10-10M）SP濃度范

9、圍內(nèi)，陽性細(xì)胞表達(dá)逐漸增加，10-10M濃度時(shí)，其達(dá)到峰值，在(10-10M～10-6M) SP濃度范圍內(nèi)，其陽性細(xì)胞表達(dá)逐漸下降。
　　6、流式檢測不同濃度SP刺激NK細(xì)胞24小時(shí)，檢測結(jié)果為不同濃度SP（終濃度為0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M）影響C57BL/6小鼠脾NK細(xì)胞的亞群，增加CD27hiCD11blo、CD27hiCD11bhi、CD27loCD11bhi的陽性細(xì)胞百分率，降