pCXN2-mIZUMO對(duì)小鼠C57BL-6生育能力的影響.pdf

1、【背景與目的】尋找方便而高效的手段來(lái)對(duì)人類進(jìn)行計(jì)劃生育和控制某些有害動(dòng)物的數(shù)量一直是科學(xué)家們感興趣的課題。隨著基因工程和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展,應(yīng)用免疫避孕疫苗控制人或動(dòng)物的生育能力成為很多國(guó)家、尤其是發(fā)展中國(guó)家研究的重點(diǎn)。不同于傳統(tǒng)意義上的感染性疾病疫苗,免疫避孕疫苗是人為地干擾正常健康機(jī)體的生殖生理過(guò)程。而基因免疫是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫技術(shù),是將抗原基因重組到真核表達(dá)載體上,經(jīng)過(guò)一定的方法轉(zhuǎn)染到動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞內(nèi),表達(dá)的抗原

2、經(jīng)過(guò)抗原提呈激活機(jī)體免疫系統(tǒng),從而誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的體液免疫和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。2005年3月,日本學(xué)者Naokazu Inoue等人第一次發(fā)現(xiàn)了Izumo蛋白,并證實(shí)這種蛋白在精卵融合中起關(guān)鍵作用,敲除了Izumo基因的精子由于喪失了與卵子質(zhì)膜融合的能力而使小鼠完全失去了生育能力。本研究通過(guò)應(yīng)用基因免疫的原理及方法,研究了IZUMO基因在小鼠C57BL/6肌肉中的表達(dá)及對(duì)其生育能力的影響,為進(jìn)一步研究人類和其他動(dòng)物生育控制方法提供實(shí)驗(yàn)依

3、據(jù)。
　　【材料和方法】1)材料①重組質(zhì)粒pCXN2-mIZUMO;②對(duì)照質(zhì)粒pCXN2;③成熟雌性和雄性C57BL/6小鼠,6-8周齡;④抗血清,取自被免疫后的C57BL/6小鼠;⑤精子,取自成熟雄性C57BL/6小鼠附睪;⑥卵母細(xì)胞,取自經(jīng)超排后的成熟雌性C57BL/6小鼠輸卵管。2)方法①構(gòu)建對(duì)照質(zhì)粒pCXN2,用酶切法鑒定對(duì)照質(zhì)粒是否構(gòu)建成功;②重組質(zhì)粒pCXN2-mIZUMO和對(duì)照質(zhì)粒pCXN2 DNA的提取和純化;③實(shí)

4、驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠的免疫前預(yù)處理:每次免疫前用0.25％鹽酸布比卡因多點(diǎn)注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左后腿脛前肌,提高DNA的攝取效率。3天后在同一部位進(jìn)行DNA免疫;④實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠的免疫:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成兩組,分別用重組質(zhì)粒pCXN2-mIZUMO和對(duì)照質(zhì)粒pCXN2免疫小鼠;⑤血清的制備:每次免疫前和最后一次免疫完成后2周從尾靜脈取血制備血清;⑥RT-PCR檢測(cè)pCXN2-mIZUMO在小鼠體內(nèi)的表達(dá);⑦ELISA法測(cè)定血清中

5、抗 Izumo抗體的滴度;⑧體外受精(IVF)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗血清在體外的作用;⑨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合籠后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)仔數(shù),分析免疫對(duì)小鼠生育能力的影響。
　　【結(jié)果】①酶切鑒定用EcoRⅠ行單酶切,HindⅢ和XbaⅠ行雙酶切,分別對(duì)重組質(zhì)粒pCXN2-mIZUMO和構(gòu)建的對(duì)照質(zhì)粒 pCXN2進(jìn)行酶切鑒定,均得到相應(yīng)的特異性片段。說(shuō)明對(duì)照質(zhì)粒構(gòu)建成功,重組質(zhì)粒正確無(wú)誤;②RT-PCR用1%的瓊脂糖凝膠電泳得到RT-PCR產(chǎn)物為468 bp,產(chǎn)物堿基測(cè)

6、序結(jié)果經(jīng) BLAST比對(duì)分析后證實(shí)為 C57BL/6小鼠Izumo的特異性mRNA片斷,說(shuō)明質(zhì)粒pCXN2-mIZUMO在小鼠的體內(nèi)可以表達(dá);③ELISA檢測(cè)重組質(zhì)粒 pCXN2-mIZUMO第一次免疫小鼠后2周即可檢測(cè)到抗 Izumo特異性抗體,經(jīng)過(guò)二次加強(qiáng)免疫后抗體水平從0~6周持續(xù)升高并維持在較高的水平;④體外受精試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組受精率為11.6%,對(duì)照組受精率為25.2%,統(tǒng)計(jì)分析表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05;⑤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合籠免疫

7、雌鼠與正常雄鼠交配,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間產(chǎn)仔數(shù)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05;而免疫雄鼠與正常雌鼠交配,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的產(chǎn)仔數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　【結(jié)論】①對(duì)照質(zhì)粒pCXN2構(gòu)建成功;②重組質(zhì)粒pCXN2-mIZUMO可以在小鼠骨骼肌細(xì)胞中表達(dá);③經(jīng)重組質(zhì)粒pCXN2-mIZUMO免疫的小鼠體內(nèi)誘發(fā)了抗Izumo特異性免疫應(yīng)答。;④經(jīng)重組質(zhì)粒pCXN2-mIZUMO免疫后的小鼠抗血清在體外可以降低其受精率;⑤經(jīng)重組質(zhì)粒pCXN2-