非典型抗精神病藥氯氮平對C57BL-6雄性小鼠血糖的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、一、目的： 通過研究不同劑量氯氮平單用或者與氟伏沙明合用對C57BL/6雄性小鼠代謝的影響，探討氯氮平影響血糖的機(jī)制。 二、方法： 1.氯氮平單用或與氟伏沙明合用對C57BL/6雄性小鼠血糖和血脂的影響 120只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分成6組：(1)空白對照組；(2)氯氮平2mg/kg組；(3)氯氮平10mg/kg組；(4)氟伏沙明2mg/kg組；(5)氯氮平2mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組；(6

2、)氯氮平10mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組；上述各組小鼠連續(xù)28d早晨8:30腹腔注射給予相應(yīng)藥物，在給藥前稱小鼠的體重和測定空腹血糖(FBS)，并于給藥后7d、14d、21d、28d稱小鼠體重。在試驗(yàn)的第29d斷尾取血測定每只小鼠FBS、糖耐量(給小鼠腹腔注射25％的葡萄糖2g/kg，測定給葡萄糖后30min、60min、120min血糖)，再用戊巴比妥鈉(130mg/kg)麻醉小鼠，然后摘除小鼠眼球，取0.6mL眼眶血置于肝素抗

3、凝管中。每組小鼠中10個(gè)血樣用于測定胰島素和血脂水平。 2.氟伏沙明對小鼠體內(nèi)氯氮平及其代謝物血濃度的影響　 測定上述試驗(yàn)中第(2)氯氮平2mg/kg組、(3)氯氮平10mg/kg組、(5)氯氮平2mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組、(6)氯氮平10mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組各組中另外10只小鼠血漿中的氯氮平、去甲氯氮平和N-氧化氯氮平血藥濃度。并將小鼠的血藥濃度與空腹血糖、血脂進(jìn)行相關(guān)性分析。 首先建立

4、HPLC-MS/MS同時(shí)測定氯氮平、去甲氯氮平和N-氮氧化氯氮平血藥濃度的方法，采用色譜柱為Waters XteraTM　MS C18柱(150mm×3.9mm，粒徑5μm)，柱溫40℃，流動相：乙腈-水(36:64，含10mmol/L醋酸銨與0.01％甲酸，pH=5.96)，流速：1.0mL/min。質(zhì)譜檢測采用Waters ZQ二極質(zhì)譜儀，選用ESI+，掃描方式為選擇離子(SIR)檢測。樣品用氮?dú)獯蹈珊笤儆昧鲃酉嗳芙猓M(jìn)樣量20μL

5、。 3.氯氮平影響小鼠血糖的機(jī)制研究 把摘除眼球取血后的小鼠頸椎脫臼處死，取小鼠胰腺和股四頭肌。小鼠胰腺置于10％中性福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，制作石蠟切片(2份)，厚度約4μm。小鼠股四頭肌置于液氮中速凍，再轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱保存至測定。 (1)采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定6組小鼠股四頭肌中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)mRNA的表達(dá)。 (2)一份胰腺石蠟切片常規(guī)脫蠟行蘇木精-伊紅

6、染色，光鏡下觀察6組小鼠胰腺胰島淋巴細(xì)胞浸潤情況。 (3)另一份石蠟切片用TUNEL原位末端標(biāo)記法標(biāo)記凋亡的β細(xì)胞，用SABC免疫組化法標(biāo)記β細(xì)胞，進(jìn)行β細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)。 (4)GLUT mRNA表達(dá)量、胰島淋巴細(xì)胞浸潤程度、β細(xì)胞凋亡率與小鼠的空腹血糖、血脂、氯氮平及其代謝物血藥濃度進(jìn)行相關(guān)性分析。 三、結(jié)果： 1.氯氮平單用或與氟伏沙明合用對C57BL/6雄性小鼠血糖和血脂的影響 試驗(yàn)前各個(gè)試驗(yàn)

7、組的體重和空腹血糖(FBS)統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著性差異(P>0.05)；與空白對照組相比，在給藥后第14d、21d和28d 2mg/kg氯氮平組小鼠的體重降低，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著性差異(P>0.05)；而10mg/kg氯氮平組小鼠的體重降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05)。與空白對照組相比，氯氮平2mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組小鼠的體重統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著性差異(P>0.05)；而氯氮平10mg/kg +氟伏沙明2mg/kg組小鼠在

8、給藥后第21d、28d的體重降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05)。與氯氮平單用組相比，氟伏沙明與氯氮平合用組小鼠的體重統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著性差異(P>0.05)。與空白對照組相比，空腹血糖(FBG)、葡萄糖耐量(IGR)、胰島素水平和胰島素耐受指數(shù)(IRI)只在10mg/kg氯氮平單用組升高(P<0.05)；此外，高密度脂蛋白水平(HDL-C)只在10mg/kg氯氮平單用組降低(P<0.05)。 2.氟伏沙明對小鼠體內(nèi)氯氮平及

9、其代謝物血濃度的影響 氟伏沙明對小鼠氯氮平的代謝有抑制作用，與氯氮平2mg/kg單用組相比，氯氮平2mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組血中氯氮平、去甲基氯氮平、N-氧化氯氮平濃度統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05)，單用組與兩藥合用組濃度分別為97.61±10.62ng/mL， 176.97±13.61ng/mL(氯氮平濃度)；72.17±10.11ng/mL，20.35±2.71ng/mL(去甲基氯氮平濃度)；8.42±1.8

10、8ng/mL，14.89±3.21ng/mL(N-氧化氯氮平濃度)。與氯氮平10mg/kg單用組相比，氯氮平10mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組的氯氮平、去甲基氯氮平、N-氧化氯氮平血藥濃度統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05)，單用組與兩藥合用組藥物濃度分別為325.07±43.49ng/mL，727.30±73.34ng/mL(氯氮平濃度)；112.77±14.00ng/mL，23.99±6.25ng/mL(去甲基氯氮平濃度)；31

11、.74±6.37ng/mL，39.32±7.16ng/mL(N-氧化氯氮平濃度)。SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，氯氮平、去甲氯氮平和N-氧化氯氮平血藥濃度與小鼠的空腹血糖(FBS)、血脂統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有相關(guān)性(P>0.05)，但是小鼠的FBS值有隨去甲氯氮平濃度增加而增加的趨勢。 3.氯氮平影響小鼠血糖的機(jī)制研究 (1)空白對照組小鼠股四頭肌中GLUT4 mRNA含量與內(nèi)參β-actin mRNA表達(dá)量之比值為1.02+0.2

12、 1，氯氮平2mg/kg組、氯氮平10mg/kg組、氟伏沙明2mg/kg組、氯氮平2mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組、氯氮平10mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組小鼠股四頭肌中GLUT4 mRNA含量與內(nèi)參β-actin mRNA表達(dá)量之比值分別為：0.81±0.20、0.79±0.18、0.95±0.09、0.984±0.06和1.01±0.18。在GLUT4 mRNA與β-actin mRNA表達(dá)量之比值方面，與空白對照組相比，氯

13、氮平2mg/kg組和氯氮平10mg/kg組統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05)，氟伏沙明2mg/kg組與空白對照組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著性差異(P>0.05)；氯氮平2mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組和氯氮平10mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組分別比氯氮平2mg/kg組和氯氮平10mg/kg組的比值高，但是只有氯氮平2mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組和氯氮平2mg/kg組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05)。 (2)高倍

14、光學(xué)顯微鏡下觀察HE切片，空白對照組、氯氮平2mg/kg組、氟伏沙明2mg/kg組、氯氮平2mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組、氯氮平10mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組小鼠的胰島均位于胰腺外分泌部之中，其島型豐滿、輪廓清晰、胰島細(xì)胞均勻分布，均未見淋巴細(xì)胞浸潤；盡管氯氮平10mg/kg組小鼠胰島位于胰腺外分泌部之中，其島型豐滿、輪廓清晰、胰島細(xì)胞均勻分布，未見淋巴細(xì)胞浸潤，但是該組有2只小鼠的胰島周圍有淋巴細(xì)胞浸潤，但胰島內(nèi)無淋巴細(xì)

15、胞浸潤。 (3)空白對照組、氯氮平2mg/kg組、氯氮平10mg/kg組、氟伏沙明2mg/kg組、氯氮平2mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組、氯氮平10mg/kg+氟伏沙明2mg/kg組胰島細(xì)胞分布均勻，β細(xì)胞胞漿呈棕黃色胰島素陽性表達(dá)，未見β細(xì)胞凋亡。 (4)小鼠GLUT4 mRNA相對表達(dá)量與小鼠空腹血糖、去甲氯氮平血藥濃度的值呈負(fù)相關(guān)(P<0.05，r=-0.814，r=-0.940)，小鼠GLUT4mRNA相對表

16、達(dá)量與小鼠的血脂、氯氮平、N-氧化氯氮平血藥濃度的值不相關(guān)(P>0.05，r=0.347～0.555)。 四結(jié)論： 連續(xù)28d給雄性C57BL/6小鼠腹腔注射10mg/kg氯氮平，可以降低小鼠體重及高密度脂蛋白水平(HDL-C)，升高小鼠空腹血糖、糖耐量及胰島素水平。研究發(fā)現(xiàn)：單獨(dú)給予2mg/kg氟伏沙明治療沒有上述作用，氟伏沙明(2 mg/kg)聯(lián)合10mg/kg氯氮平治療可以改善10mg/kg氯氮平對血糖、血脂的不良

17、影響。此結(jié)果為臨床上氯氮平和氟伏沙明聯(lián)合使用提供理論依據(jù)。 氟伏沙明與氯氮平聯(lián)合使用可以抑制氯氮平的代謝，使去甲氯氮平的血濃度明顯降低。研究發(fā)現(xiàn)：小鼠的空腹血糖與去甲氯氮平的濃度沒有顯著性相關(guān)，但有隨氯氮平血藥濃度升高而升高的趨勢。這提示：氟伏沙明可以降低小鼠血漿中去甲氯氮平的血濃度，這可能是其與氯氮平聯(lián)合使用可以改善氯氮平對血糖的升高作用的重要機(jī)制之一。此結(jié)果為臨床上使用氯氮平患者出現(xiàn)血糖升高的個(gè)體差異性提供理論依據(jù)。