Notch信號(hào)通路在非典型抗精神病藥物喹硫平促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生中的作用.pdf

1、研究目的:
　　1.構(gòu)建cuprizone誘導(dǎo)的小鼠精神分裂癥動(dòng)物模型,觀察其精神分裂樣行為、大腦髓鞘相關(guān)蛋白及Notch通路信號(hào)分子的改變。
　　2.觀察喹硫平干預(yù)對(duì)cuprizone模型小鼠精神分裂樣行為、髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)以及Notch信號(hào)通路的影響,探討Notch信號(hào)通路在喹硫平促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生中的作用。
　　研究方法:
　　本研究分為兩部分進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)一主要觀察喹硫平對(duì)cuprizone精神分裂癥模型小

2、鼠的精神分裂樣行為的作用以及對(duì)大腦髓鞘相關(guān)蛋白(髓鞘堿性蛋白myelin basic protein,MBP、2’,3’-環(huán)核苷酸3’磷酸二酯酶2',3'-Cyclic-nucleotide3'-phosphodiesterase,CNPase)、Notch1受體及其下游效應(yīng)分子Hes1表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)二經(jīng)側(cè)腦室給予Notch信號(hào)通路γ-內(nèi)分泌酶抑制劑MW167,探究給藥前后小鼠行為學(xué)及腦組織上述蛋白表達(dá)的改變情況。
　　在實(shí)驗(yàn)一

3、,C57BL/6小鼠被隨機(jī)分為四組:(1)陰性對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)小鼠常規(guī)飼養(yǎng)6周;(2)對(duì)照+喹硫平組,實(shí)驗(yàn)小鼠常規(guī)飼養(yǎng)6周,同時(shí)給予喹硫平干預(yù);(3) cuprizone模型組,實(shí)驗(yàn)小鼠給予cuprizone處理6周;(4)cuprizone+喹硫平組,實(shí)驗(yàn)小鼠同時(shí)給予cuprizone處理及喹硫平干預(yù)6周。觀察指標(biāo)包括:1.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、Y-迷宮實(shí)驗(yàn)、三箱實(shí)驗(yàn)和筑巢實(shí)驗(yàn);2.采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢

4、測(cè)大腦MBP、 CNPase蛋白表達(dá)情況;3.采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)及RT-PCR方法檢測(cè)腦組織Notch1受體及Hes1蛋白表達(dá)及其mRNA豐度。
　　在實(shí)驗(yàn)二,C57BL/6小鼠被隨機(jī)分為六組:(1)陰性對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)小鼠常規(guī)飼養(yǎng)6周;(2)對(duì)照+喹硫平組,實(shí)驗(yàn)小鼠常規(guī)飼養(yǎng)6周,同時(shí)給予喹硫平干預(yù);(3) cuprizone模型組,實(shí)驗(yàn)小鼠給予cuprizone處理6周;(4)cuprizone+喹硫平

5、組,實(shí)驗(yàn)小鼠同時(shí)給予cuprizone處理及喹硫平干預(yù)6周;(5)對(duì)照+MW167組,實(shí)驗(yàn)小鼠于實(shí)驗(yàn)的適應(yīng)性飼養(yǎng)時(shí)期行右側(cè)腦室置管術(shù),待小鼠從手術(shù)中恢復(fù)、充分適應(yīng)置管1星期之后進(jìn)入模型制作階段,即常規(guī)飼養(yǎng)6周,自第6周開(kāi)始經(jīng)側(cè)腦室給予MW167,每天給藥1次,連續(xù)給藥7天;(6)cuprizone+喹硫平+ MW167組,實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)過(guò)置管適應(yīng)期后同時(shí)給予cuprizone處理及喹硫平干預(yù)6周,自第6周開(kāi)始經(jīng)側(cè)腦室給予MW167,每天給藥

6、1次,連續(xù)給藥7天。觀察指標(biāo)包括:1.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、Y-迷宮實(shí)驗(yàn)和三箱實(shí)驗(yàn);2.采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)大腦MBP、Hes1和Hes5蛋白表達(dá)量。
　　研究結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一發(fā)現(xiàn),小鼠經(jīng) cuprizone處理后出現(xiàn)精神分裂樣行為學(xué)表現(xiàn),并且 MBP,CNPase蛋白表達(dá)降低,Notch1受體、Hes1分子的表達(dá)下調(diào);經(jīng)喹硫平干預(yù)后,cuprizone模型小鼠的分裂癥樣行為得以改善,并且MBP,CNP

7、ase表達(dá)升高,Notch1受體、Hes1分子的表達(dá)上調(diào)。具體結(jié)果如下:
　　1.與陰性對(duì)照組相比,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,CPZ組小鼠的水平運(yùn)動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間及中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離百分比均減少(P<0.01);高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中,CPZ組小鼠進(jìn)入各個(gè)臂的總次數(shù)、開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比以及開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比均明顯增高(P均<0.01);Y迷宮實(shí)驗(yàn)中,CPZ組小鼠的正確轉(zhuǎn)換率明顯降低(P<0.01);三箱實(shí)驗(yàn)中,CPZ組小鼠在空金屬網(wǎng)實(shí)驗(yàn)箱與在st

8、ranger1實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而在stranger1實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間明顯多于在stranger2實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間(P<0.01);筑巢實(shí)驗(yàn)中,CPZ組小鼠的筑巢評(píng)分明顯降低(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示CPZ組小鼠大腦MBP,CNPase表達(dá)降低(P均<0.05);免疫熒光染色結(jié)果表明CPZ組小鼠大腦MBP熒光強(qiáng)度減弱(P<0.01);Western blot及RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明CPZ組小鼠大腦Not

9、ch1受體、Hes1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)下調(diào)(P均<0.05)。
　　2.與CPZ組相比,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,CPZ+喹硫平組小鼠的水平運(yùn)動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間、中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離百分比均明顯增加(P<0.05);高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中,CPZ+喹硫平組小鼠進(jìn)入各個(gè)臂的總次數(shù)、開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比以及開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比均明顯增高(P<0.01);Y迷宮實(shí)驗(yàn)中,CPZ+喹硫平組小鼠的正確轉(zhuǎn)換率明顯增高(P<0.01);三箱實(shí)驗(yàn)中,CPZ+喹硫平組小鼠在st

10、ranger1實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間明顯多于在空金屬網(wǎng)實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間,而在stranger2實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間明顯多于在stranger1實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間(P均<0.01);筑巢實(shí)驗(yàn)中,CPZ+喹硫平組小鼠的筑巢評(píng)分增高(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示CPZ+喹硫平組小鼠大腦MBP,CNPase表達(dá)升高(P均<0.05);免疫熒光染色結(jié)果表明CPZ+喹硫平組小鼠大腦MBP熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P<0.05);Western blot及RT-

11、PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明CPZ+喹硫平組小鼠大腦Notch1受體、Hes1蛋白的表達(dá)上調(diào)(P均<0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)二發(fā)現(xiàn),小鼠經(jīng) cuprizone處理后出現(xiàn)精神分裂樣行為學(xué)表現(xiàn),并且 MBP表達(dá)降低,Notch信號(hào)通路的下游分子Hes1、Hes5的表達(dá)下調(diào);經(jīng)喹硫平干預(yù)后,cuprizone模型小鼠的分裂樣行為得以改善,并且MBP表達(dá)升高,Hes1、Hes5分子的表達(dá)上調(diào);預(yù)先給予MW167干預(yù),小鼠腦組織Hes1、Hes5分子

12、表達(dá)量降低,同時(shí)喹硫平的促進(jìn)髓鞘形成作用與改善精神分裂樣行為作用消失。具體結(jié)果如下:
　　1.與陰性對(duì)照組相比,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,CPZ組、CPZ+喹硫平組、對(duì)照+MW167組以及CPZ+喹硫平+ MW167組小鼠的水平運(yùn)動(dòng)距離均減少(P<0.01),CPZ組和CPZ+喹硫平+ MW167組小鼠中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間及中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離百分比均減少(P<0.01);Y迷宮實(shí)驗(yàn)中,CPZ組和CPZ+喹硫平+ MW167組小鼠的正確轉(zhuǎn)換率明顯降低(P<

13、0.05);三箱實(shí)驗(yàn)中,CPZ組和CPZ+喹硫平+ MW167組小鼠在空金屬網(wǎng)所在實(shí)驗(yàn)箱、stranger1所在實(shí)驗(yàn)箱以及stranger2所在實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western blot結(jié)果顯示CPZ組小鼠大腦Hes1,Hes5及MBP表達(dá)降低(P<0.05);免疫熒光染色結(jié)果表明CPZ組和CPZ+喹硫平+ MW167組小鼠大腦MBP熒光強(qiáng)度降低(P均<0.01)。
　　2.與CPZ組相比,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,CPZ+喹硫平組小

14、鼠的水平運(yùn)動(dòng)距離明顯增多(P<0.01),中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05),中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離百分比增加(P<0.01);Y迷宮實(shí)驗(yàn)中,CPZ+喹硫平組小鼠的正確轉(zhuǎn)換率明顯增高(P<0.01);三箱實(shí)驗(yàn)中,CPZ+喹硫平組小鼠在stranger1實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間明顯多于在空金屬網(wǎng)實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間,而在stranger2實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間明顯多于在stranger1實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間(P均<0.05)。Western blot結(jié)果顯示CPZ+喹硫平組小

15、鼠大腦Hes1,Hes5以及MBP表達(dá)升高(P均<0.05);免疫熒光染色結(jié)果表明不同區(qū)域CPZ+喹硫平組小鼠大腦MBP熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P均<0.01)。
　　3.與CPZ+喹硫平組比較,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,CPZ+喹硫平+ MW167組小鼠的水平運(yùn)動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間及中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離百分比均明顯減小(P均<0.05);Y迷宮實(shí)驗(yàn)中,CPZ+喹硫平+ MW167組小鼠的正確轉(zhuǎn)換率顯著降低(P<0.05);三箱實(shí)驗(yàn)中,CPZ+喹硫平+ MW

16、167組小鼠在stranger1實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間與之在空金屬網(wǎng)實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間無(wú)顯著性差異,而在stranger1實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間明顯多于在stranger2實(shí)驗(yàn)箱停留時(shí)間(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示CPZ+喹硫平+ MW167組小鼠大腦Hes1,Hes5以及MBP表達(dá)降低(P均<0.05);免疫熒光染色結(jié)果表明不同區(qū)域CPZ+喹硫平+ MW167組小鼠大腦MBP熒光強(qiáng)度減弱(P均<0.01)。
　　結(jié)論: