日本血吸蟲感染C57BL-6小鼠肝臟和肺臟中IL-17的特點.pdf

1、血吸蟲病是一種由蟲卵肉芽腫引起的慢性免疫性疾病，其病理基礎(chǔ)是沉積于組織內(nèi)大量的成熟蟲卵對機體的刺激、宿主對活毛蚴分泌的可溶性抗原產(chǎn)生的病理性免疫應(yīng)答，并形成蟲卵肉芽腫以及繼發(fā)肝纖維化。日本血吸蟲感染后，多細胞結(jié)構(gòu)的寄生蟲伴其分泌的多種抗原誘導(dǎo)會導(dǎo)致多種細胞因子的產(chǎn)生，進而介導(dǎo)免疫應(yīng)答，這些細胞因子很可能是治療日本血吸蟲病的治療靶標。有報道顯示，血吸蟲感染的免疫病理反應(yīng)與IL-17是密切相關(guān)的。IL-17可能在血吸蟲卵引起的免疫病理損害中

2、起重要作用。文獻報道，Th17細胞為IL-17的主要細胞來源，而其它固有免疫細胞如γδ-T細胞、NK細胞、Tc17細胞、中性粒細胞和嗜酸粒細胞也可表達IL-17。但也有報道表明IL-17主要由γδT細胞分泌。在不同疾病的不同階段或者不同模型，以及不同病變部位分泌IL-17的主要細胞來源都可能不同。
　　本研究的目的是了解在日本血吸蟲感染小鼠肝臟和肺臟中IL-17的特點以及作用。我們分別研究了肝臟和肺臟中IL-17的產(chǎn)生情況，并比較

3、了不同T淋巴細胞亞群，包括CD4+T細胞，NKT細胞和γδT細胞在非特異性刺激劑PMA和離子霉素作用下IL-17的分泌情況，以探索感染后產(chǎn)生IL-17的主要淋巴細胞亞群。
　　為了進一步明確IL-17在日本血吸蟲感染小鼠肝臟和肺臟肉芽腫病變中的作用，我們在小鼠感染3周后開始注射IL-17中和抗體，以降低感染小鼠體內(nèi)IL-17的水平，從而探討IL-17是否在宿主的抗血吸蟲感染的過程中發(fā)揮作用。本研究將分別研究肝臟和肺臟兩個不同器官中

4、IL-17的特點，分為兩個部分：一、C57BL/6小鼠感染日本血吸蟲后肝臟中IL-17的特點。二、日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠肺臟中Th17的動態(tài)分布以及特點。
　　一、C57BL/6小鼠感染日本血吸蟲后肝臟中IL-17的表達及特點
　　建立日本血吸蟲人工感染C57BL/6小鼠模型，感染后6w左右剖殺，制備肝臟淋巴細胞懸液，加入非特異性刺激劑anti-CD3mAb+anti-CD28 mAb體外培養(yǎng)4h，實時熒光定量PC

5、R檢測肝臟組織IL-17、IFN-γ的mRNA含量變化；同時加入非特異性刺激劑anti-CD3mAb+anti-CD28mAb體外培養(yǎng)72h，ELISA檢測培養(yǎng)上清中細胞因子IL-17和IFN-γ的變化；流式細胞術(shù)檢測感染前后淋巴細胞中產(chǎn)生IL-17的CD3+細胞和CD3-細胞的百分比含量的變化；通過流式細胞術(shù)檢測CD3+細胞中不同亞群（CD4+細胞、NKT細胞、γδT細胞）產(chǎn)生IL-17的情況；為了進一步明確IL-17在日本血吸蟲感染

6、C57BL/6小鼠肝臟肉芽腫病變中的作用，我們在小鼠感染3w后開始注射IL-17中和抗體或同型抗體，62.5μg/次/只，每隔3d一次，共4次，末次注射48h后處死小鼠，觀察C57BL/6感染小鼠體內(nèi)IL-17被中和后對肉芽腫炎癥反應(yīng)及肝臟損傷的影響，通過HE染色檢測肝臟組織的肉芽腫炎癥反應(yīng)的變化，同時比較肉芽腫面積；Masson染色觀察小鼠肝臟纖維化的嚴重程度，ELISA法觀察小鼠血清中III型前膠原(PC-III)和IV型膠原(IV

7、-C)含量，進一步確定肝臟纖維化程度；用ELISA法檢測正常對照組，同型對照組以及Anti-IL-17組血清中SEA特異性IgG和IgE含量。
　　結(jié)果表明C57BL/6小鼠感染日本血吸蟲后，肝臟組織中IL-17mRNA和蛋白表達均在感染后明顯增加，提示IL-17的表達可能與肉芽腫炎癥形成密切相關(guān)；同時CD3+細胞產(chǎn)生IL-17的百分比在血吸蟲感染后明顯上升，和IL-17+CD3-細胞相比，含量較高，且增加較明顯，提示肝臟淋巴細胞

8、中CD3+細胞為產(chǎn)生IL-17的主要細胞群；進一步發(fā)現(xiàn)感染后IL-17+γδT細胞和IL-17+CD4+T細胞占整個T細胞的百分比之間是沒有統(tǒng)計學(xué)差別的，但約25％γδT細胞產(chǎn)生IL-17，其比例遠高于CD4+T細胞和NKT細胞，且肝臟IL-17+γδT細胞中IL-17的平均熒光強度最高。Anti-IL-17組和同型對照組相比，肝臟外觀炎癥有所緩解，HE染色以及統(tǒng)計結(jié)果也表明肉芽腫明顯減小，同時，纖維化的檢測也表明anti-IL-17組

9、纖維化有所緩解，為IL-17可能參與、調(diào)節(jié)肉芽腫病變提供了有力的證據(jù)。Anti-IL-17組中SEA特異性IgG和同型對照組相比有所增加，但是IgE含量變化不明顯，表明IL-17可能抑制了SEA特異性IgG的產(chǎn)生，但是對IgE影響較小。
　　二、日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠肺臟中Th17的動態(tài)分布以及特點
　　建立日本血吸蟲人工感染C57BL/6小鼠模型，于感染后6w左右剖殺，無菌取肺臟，分離肺臟淋巴細胞，計數(shù)，并采用流

10、式細胞術(shù)檢測CD3+和CD4+CD3+細胞百分含量以及絕對數(shù)目；用雙抗體夾心ELISA法檢測正常對照組與感染組中IFN-γ，IL-4，IL-17水平。檢測感染后產(chǎn)生IFN-γ，IL-4，IL-17的CD3-細胞和CD3+細胞含量。流式細胞術(shù)檢測不同細胞亞群（CD4+T，CD8+T，NKT，γδT細胞）產(chǎn)生IFN-γ，IL-4，IL-17的情況；動態(tài)觀察CD4+T細胞在感染后0、4、5、6、7w產(chǎn)生IFN-γ，IL-4，IL-17的含量。

11、Th17細胞共表達IFN-γ，IL-4，IL-5，IL-9，IL-10的水平。通過HE染色檢測肺臟組織的肉芽腫炎癥反應(yīng)的變化。
　　結(jié)果表明C57BL/6小鼠感染日本血吸蟲后，肺臟淋巴細胞有所增加，且CD3+細胞和CD4+細胞在感染后百分比以及含量都增加明顯。ELISA結(jié)果表明IFN-γ， IL-4，IL-17蛋白含量在感染后增加。感染后CD3+細胞產(chǎn)生的IFN-γ，IL-4，IL-17增加明顯，且CD3+IFN-γ+，CD3+I

12、L-4+，CD3+IL-17+細胞百分比都高于相應(yīng)的CD3-細胞。CD4+細胞產(chǎn)生IL-17的含量高于其他亞群。IL-17+CD4+細胞的動態(tài)分布圖表明在感染后其持續(xù)增加；Th17細胞分泌的IL-4和IL-5水平較其他細胞因子高，且?guī)缀醪环置贗L-9，IL-10。在感染過程中產(chǎn)生的IL-17加強了肺臟中肉芽腫炎癥，表明IL-17可能加重了日本血吸蟲感染的肺臟的病原性的產(chǎn)生。
　　總而言之，本研究描述了C57BL/6小鼠感染日本血吸

13、蟲后肝臟和肺臟中細胞因子IL-17的特點和作用。我們發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲感染后肝臟和肺臟中IL-17的含量明顯提高，肝臟中IL-17可能主要由γδT細胞產(chǎn)生，而肺臟中的IL-17由Th17細胞分泌。IL-17的表達水平與血吸蟲感染誘導(dǎo)的肉芽腫炎癥的嚴重程度以及纖維化程度密切相關(guān)；阻斷IL-17的治療可能成為減輕、治療血吸蟲蟲卵肉芽腫病變的有效途徑。我們的研究完善了日本血吸蟲感染小鼠模型中Th細胞因子的變化規(guī)律，豐富了血吸蟲肉芽腫病變的免疫調(diào)節(jié)