日本血吸蟲感染C57BL-6小鼠腸系膜淋巴結(jié)Th17細(xì)胞和天然免疫細(xì)胞的特征.pdf

1、日本血吸蟲病嚴(yán)重影響著我國人民的身體健康以及制約著我國國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。日本血吸蟲病主要是血吸蟲尾蚴經(jīng)皮膚感染，成蟲在腸道定居、產(chǎn)卵并形成蟲卵肉芽腫導(dǎo)致肝、肺組織纖維化。腸系膜淋巴結(jié)為腸腔內(nèi)主要的引流淋巴結(jié)，在受到外界抗原刺激后能誘導(dǎo)其內(nèi)的淋巴細(xì)胞活化、增殖和分化，從而發(fā)揮一系列的免疫應(yīng)答效應(yīng)。Th17在血吸蟲感染誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的作用。γδT細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞都屬于天然免疫細(xì)胞，在多種感染性和腫瘤性疾病的早期反應(yīng)中發(fā)

2、揮著重要的作用。本研究采用日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠動物模型，通過流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）等方法觀察腸系膜淋巴結(jié)Th17細(xì)胞和天然免疫細(xì)胞的含量和功能的變化情況。
　　研究目的:
　　觀察日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠所誘導(dǎo)的腸系膜淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞和天然免疫細(xì)胞的特

3、征。
　　研究方法：
　　1.動物感染模型建立：將40只6~8周齡雌性SPF級C57BL/6小鼠隨機(jī)分成感染組和對照組（每組20只），感染組小鼠通過腹部貼片法感染（40±5條）日本血吸蟲尾蚴。
　　2.組織取材及制備單個細(xì)胞懸液：正常小鼠和感染小鼠，分別分離腸系膜淋巴結(jié)，研磨，通過200目篩網(wǎng)過濾，洗滌，制備成單個細(xì)胞懸液。
　　3.培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子檢測：調(diào)整淋巴細(xì)胞密度為2×106/ml，四種不同條件刺激7

4、2 h：①不刺激對照；②SEA(不同濃度)+anti-CD28（1μg/ml）；③SWA（不同濃度）+anti-CD28（1μg/ml）；④anti-CD3（1μg/ml）+anti-CD28（1μg/ml）。ELISA法檢測淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-17和IFN-γ的水平。
　　4.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測IL-17和轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt的mRNA水平：調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml，在細(xì)胞懸液中加入或不加anti-CD3

5、（1μg/ml）和anti-CD28（1μg/ml）共同刺激4 h。提取淋巴細(xì)胞的總RNA，將總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
　　5.流式細(xì)胞學(xué)檢測：制備腸系膜淋巴結(jié)單個細(xì)胞懸液，經(jīng)不同條件刺激：①不刺激對照；②PMA（20 ng/ml）+Ionomycin（1μg/ml）；③SEA（100μg/ml）+anti-CD28（1μg/ml）；④SWA（100μg/ml）+anti-CD2

6、8（1μg/ml）；⑤anti-CD3（1μg/ml）+anti-CD28（1μg/ml）。1 h后加入BFA（10μg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4.5 h。經(jīng)固定、破膜和穿孔，加入相應(yīng)熒光抗體染色，使用流式細(xì)胞儀檢測分析。
　　研究結(jié)果：
　　1. ELISA方法檢測結(jié)果表明感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞經(jīng)anti-CD3+anti-CD28刺激72 h，細(xì)胞上清液中IL-17和IFN-γ水平含量明顯高于正常小鼠（P<0.05）。

7、
　　2. RT-PCR結(jié)果表明感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞經(jīng) anti-CD3+anti-CD28刺激4 h，其中IL-17和轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于正常小鼠（P<0.05）。
　　3.流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明日本血吸蟲感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)中IL-17+CD4+T細(xì)胞含量明顯高于正常小鼠（P<0.05）。
　　4.流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明日本血吸蟲感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)中CD4+T細(xì)胞的IL-17+IL-4+細(xì)

8、胞占0.06％， IL-17+IFN-γ+和IL-17+IL-5+細(xì)胞均占0.02%，IL-17+IL-9+細(xì)胞占0.01%。未檢測到IL-17+IL-10+和IL-17+foxp3+細(xì)胞。
　　5. ELISA結(jié)果表明SEA和SWA刺激日本血吸蟲感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17和IFN-γ明顯高于正常小鼠（P<0.05）。
　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測 SEA刺激感染小鼠腸系膜淋巴結(jié) IL-17+CD4+T細(xì)胞和I

9、FN-γ+CD4+T細(xì)胞的含量分別為0.43%和0.56%，明顯高于正常組0.05%和0.20%（P<0.05）；SWA刺激感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)IL-17+CD4+T細(xì)胞和IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的含量分別為0.39%和0.76%，明顯高于正常組0.04%和0.19%（P<0.05）。
　　7.感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)γδT細(xì)胞的細(xì)胞絕對數(shù)為19.4±0.78×104，明顯高于正常組8.1±0.87×104（P<0.05）；活化分子

10、CD69在感染小鼠的γδT細(xì)胞中的含量為29.83±1.2%，明顯高于正常小鼠6.35±0.63%（P<0.01）。
　　8.感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)CD4+γδT細(xì)胞的含量為6.49±2.26%，明顯高于正常小鼠2.6±1.39%（P<0.05）；感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)CD8+γδT細(xì)胞、CD4+CD8+γδT細(xì)胞和CD4-CD8-γδT細(xì)胞與正常小鼠無明顯差異性（P>0.05）。
　　9.感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)IL-4+γδT細(xì)

11、胞、IL-9+γδT細(xì)胞和IL-17+γδT細(xì)胞含量分別為6.51±0.72%、0.68±0.18%和10.75±1.56%，明顯高于正常小鼠3.4±1.52%、0.29±0.08%和4.31±1.14%（P<0.05）。
　　10.感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)NK細(xì)胞的含量為5.8±1.4%，明顯高于正常小鼠2.8±0.77%（P<0.05）；感染小鼠NK細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目為（1.47±0.25）×106，也明顯高于正常小鼠（0.29±0.

12、05）×106（P<0.01）；感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)NKT細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目分別為（0.28±0.02）×106，明顯高于正常小鼠（0.11±0.03）×106（P<0.01）。
　　11.活化分子CD69在感染小鼠NK細(xì)胞中的含量為44.71±2.0%，明顯高于正常小鼠28.7±4.25%（P<0.01）；在感染小鼠NKT細(xì)胞中的含量為60.39±3.49%，明顯高于正常小鼠32.26±2.34%（P<0.01）。
　　12.

13、感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)CD4+NK細(xì)胞的含量為1.83±0.18%，明顯高于正常小鼠0.81±0.25%（P<0.01）；感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)的CD8+NK細(xì)胞、CD4+CD8+NK細(xì)胞、CD4-CD8-NK細(xì)胞、CD8+NKT細(xì)胞、CD4+CD8+NKT細(xì)胞和CD4-CD8-NKT細(xì)胞的含量與正常小鼠無明顯差異性（P>0.05）。
　　13.感染小鼠腸系膜淋巴結(jié) IL-4+NK細(xì)胞和IL-17+NK細(xì)胞分別為3.33±0.16%和

14、2.93±0.44%，明顯高于正常小鼠2.12±0.18%和1.56±0.41%（P<0.05）；感染小鼠腸系膜淋巴結(jié) IL-4+NKT細(xì)胞、IL-9+NKT細(xì)胞和IL-17+NKT細(xì)胞分別為2.17±0.90%、0.9±0.36%和3.23±1.12%，明顯高于正常小鼠1.13±0.2%、0.2±0.06%和1.08±0.08%（P<0.05）。
　　14.抑制性受體NKG2A/C/E和活化性受體NKG2D在感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)

15、的NK細(xì)胞中的含量為30.76±1.35%和46.07±6.06%，與正常小鼠55.51±4.55%和60.31±6.18%相比明顯降低（P<0.05）；抑制性受體NKG2A/C/E在感染小鼠和正常小鼠腸系膜淋巴結(jié)的NKT細(xì)胞中的含量為46.07±4.37%和47.45±2.78%，結(jié)果無顯著性差異（P>0.05）；活化性受體NKG2D在感染小鼠腸系膜淋巴結(jié)的NKT細(xì)胞中的含量為47.03±5.07%，與正常小鼠63.17±5.06%相

16、比較明顯降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠能誘導(dǎo)腸系膜淋巴結(jié)Th17細(xì)胞的產(chǎn)生；Th17細(xì)胞能分泌IL-4，可以少量分泌IFN-γ、IL-5和IL-9，不分泌IL-10，也不表達(dá)Foxp3。
　　2.日本血吸蟲感染 C57BL/6小鼠腸系膜淋巴結(jié)存在 SEA和SWA特異性Th17細(xì)胞。
　　3.日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠能誘導(dǎo)腸系膜淋巴結(jié)γδT細(xì)胞活化、增殖和分化。