旋毛形線蟲與約氏瘧原蟲共同感染對(duì)BALB-c小鼠抗瘧免疫應(yīng)答影響的研究.pdf

1、目的：
　　大量的研究數(shù)據(jù)顯示，在瘧疾流行區(qū)，瘧疾與蠕蟲病的混合感染普遍存在，并且混合感染成為這些國(guó)家和地區(qū)主要的致病和死亡原因。瘧疾和蠕蟲混合感染的相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜，免疫應(yīng)答的時(shí)效與強(qiáng)度影響宿主瘧原蟲感染的感染模式與結(jié)局?；旌细腥镜拿庖呦嚓P(guān)機(jī)制有許多未知數(shù)，其所涉及的公共衛(wèi)生問(wèn)題仍然具有意義。因此，探討瘧疾流行區(qū)瘧原蟲與蠕蟲之間的相互作用特點(diǎn)，尤其是蠕蟲感染對(duì)瘧疾免疫應(yīng)答的影響及其相關(guān)分子機(jī)制，可為抗瘧研究提供重要的策略。

2、
　　旋毛形線蟲作為食源性感染和分布廣泛的重要病原體，目前仍是瘧疾流行區(qū)與瘧原蟲混合感染的危險(xiǎn)因素之一。本研究采用預(yù)感染旋毛形線蟲小鼠模型再感染致死型約氏瘧原蟲，動(dòng)態(tài)觀察旋毛形線蟲混合感染對(duì)瘧疾感染進(jìn)程與最終結(jié)果的影響，并著重探討T細(xì)胞在感染過(guò)程中的變化以及這些變化對(duì)宿主免疫力和預(yù)后的影響，旨在進(jìn)一步揭示旋毛形線蟲與約氏瘧原蟲共同感染的相關(guān)細(xì)胞和分子機(jī)制，以期為瘧疾流行區(qū)新的防控策略的確定提供思路。
　　方法：
　　一

3、、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其模型建立
　　54只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組18只。旋毛形線蟲單獨(dú)感染對(duì)照組小鼠(TS)和實(shí)驗(yàn)組小鼠(TSPY)分別經(jīng)口感染200只旋毛形線蟲感染期幼蟲，感染1w后TSPC組經(jīng)腹腔感染1×106約氏瘧原蟲寄生的紅細(xì)胞，構(gòu)建混合感染模型。約氏瘧原蟲單獨(dú)感染對(duì)照組(PY)在同一時(shí)間點(diǎn)單純感染約氏瘧原蟲。
　　二、原蟲血癥檢測(cè)及生存率觀察
　　混合感染模型制備成功后，每天隨機(jī)取3只小鼠，經(jīng)尾靜脈采

4、血，制備薄血膜，Giemsa染色，顯微鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率并記錄小鼠生存率變化。
　　三、脾細(xì)胞熒光抗體染色
　　無(wú)菌取出感染前0d和感染后3d、5d小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，用0.17mol/L NH4Cl裂解紅細(xì)胞。以含10％胎牛血清(FAS)的RMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/ml。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1mL，每份樣品加入抗CD4-FITC單抗進(jìn)行表

5、面染色，另設(shè)陰性對(duì)照管。固定透明后，用抗IFN-γ-PE單抗、抗Gata-3-PE單抗進(jìn)行胞內(nèi)染色。用含1％FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于500μLPBS中，流式細(xì)胞儀(BectonDickinson，USA)進(jìn)行檢測(cè)。每份樣品用抗CD4-FITC和抗CD25-PE單抗進(jìn)行表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-APC單抗進(jìn)行胞內(nèi)染色，用含1％FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于500μLPBS中，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
　　四、IFN-γ

6、、IL-6及IL-10定量檢測(cè)
　　用雙抗體夾心ELISA試劑盒分別檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-6及IL-10的分泌水平。操作過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處OD值。結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1Ls軟件分析，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　五、轉(zhuǎn)錄因子分析
　　（一）RNA提取及cDNA合成
　　采用Trizol一步法提取脾細(xì)胞總R

7、NA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的含量。用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，置-20℃保存。
　　（二）引物設(shè)計(jì)
　　通過(guò)PrimerS.0在線軟件設(shè)計(jì)Foxp3，Gata-3，T-bet以及GAPDH實(shí)時(shí)定量PCR引物序列。
　?。ㄈ晒舛縋CR檢測(cè)T-bet，Gata-3及Foxp3 mRNA表達(dá)水平
　　利用SYBR GreenⅡ染料進(jìn)行各基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系(共

8、20μL)，共40個(gè)循環(huán)。為消除樣本處理、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)差異，每個(gè)樣品GAPDH、T-bet、Gata-3及Foxp3基因同時(shí)檢測(cè)3次，取平均值。
　?。ㄋ模┙y(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，標(biāo)本采用獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)比較分析組內(nèi)和組間均值差異。P小于0.05為差異顯著。
　　結(jié)果：
　　一、原蟲血癥檢測(cè)及生存率觀察
　　與PY組相比，TSPY組感染后第2d，小鼠的外周血中出現(xiàn)瘧原蟲感染

9、的紅細(xì)胞，原蟲血癥出現(xiàn)時(shí)間推遲。隨后，BALB/c小鼠原蟲血癥迅速上升，至感染后5d達(dá)到峰值，PY組峰值為64.24％，TSPY組為38.62％（峰值降低）。TSPY組在P.y17XL感染4d后相對(duì)于PY組明顯下降，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TS組小鼠全部存活，而TSPY組生存時(shí)間與TS組相比延長(zhǎng)兩天。
　　二、小鼠脾細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)
　　（一）CD4+IFN-γ+T細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)
　　與感染前相比，感染后3d、5d，TS組

10、、TSPY組小鼠CD4+ IFN-γ+T細(xì)胞均出現(xiàn)明顯增加，而PY組小鼠于感染后3d，CD4+ IFN-γ+T細(xì)胞出現(xiàn)明顯增加。TSPY組小鼠于感染后3d，CD4+ IFN-γ+T細(xì)胞顯著高于PY組小鼠。
　　（二）CD4+ Gata-3+T細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)
　　與感染前相比，感染后3d，PY組小鼠CD4+ Gata-3+T細(xì)胞出現(xiàn)明顯增加，然后迅速下降。TSPY組與PY組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?。ㄈ〤D4+ CD25+

11、 Foxp3+ Treg細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)
　　與感染前相比，感染后3d、5d，PY組小鼠Treg細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)明顯增加，感染后5d，TSPY組小鼠Treg細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)明顯增加。TSPY組小鼠于感染后5d，Treg細(xì)胞數(shù)量顯著低于PY組小鼠。
　　三、小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子檢測(cè)
　　（一）IFN-γ水平檢測(cè)
　　與感染前相比，感染后第3d、5d，TS組與TSPY組小鼠脾細(xì)胞IFN-γ分泌水平增加。PY組小鼠于感染后

12、第3d，IFN-γ分泌水平明顯增加。TSPY組小鼠于感染前及感染后第3d，IFN-γ分泌水平顯著高于PY組小鼠。
　?。ǘ㊣L-6水平檢測(cè)
　　與感染前相比，感染后3d，PY組與TSPY組小鼠IL-6分泌水平增加，然后迅速下降。TSPY組與PY組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　（三）IL-10水平檢測(cè)
　　與感染前相比，感染后3d、5d，PY組小鼠IL-10分泌水平增加，感染后5d，TSPY組小鼠IL-10分泌水平增加

13、，TSPY組小鼠于感染后5d，IL-10分泌水平顯著低于PY組小鼠。
　　四、旋毛形線蟲與鼠瘧原蟲共同感染小鼠脾細(xì)胞懸液中轉(zhuǎn)化因子檢測(cè)
　?。ㄒ唬㏕-bet水平檢測(cè)
　　與感染前相比，感染后第5d，TS組小鼠脾細(xì)胞T-bet表達(dá)增加。PY組與TSPY組小鼠于感染后第3d，T-bet表達(dá)明顯增加。TSPY組小鼠于感染后第3d，T-bet表達(dá)水平顯著高于TS組小鼠。
　?。ǘ〨ata-3水平檢測(cè)
　　與感染前

14、相比，感染后3d，PY組與TSPY組小鼠Gata-3表達(dá)增加，然后迅速下降。TSPY組與PY組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?。ㄈ〧oxp3水平檢測(cè)
　　與感染前相比，感染后3d、5d，PY組小鼠Foxp3表達(dá)增加，感染后3d，TSPY組小鼠Foxp3表達(dá)增加，TSPY組小鼠于感染后5d，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平顯著低于PY組小鼠。
　　結(jié)論：
　　1、旋毛形線蟲預(yù)感染對(duì)P.y17XL感染的小鼠具有免疫保護(hù)作用;