約氏瘧原蟲(chóng)BY265株減毒子孢子誘導(dǎo)小鼠保護(hù)性免疫的研究.pdf

1、瘧疾仍然是世界上嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。全球大約有40％的人口面臨感染瘧疾的危險(xiǎn),每年大約有1～3億的新發(fā)瘧疾病例,其中死亡人數(shù)在100～200萬(wàn)左右。瘧疾是由按蚊的叮咬傳播的。按蚊叮刺時(shí)將瘧原蟲(chóng)子孢子注入宿主體內(nèi),隨后子孢子進(jìn)入血液循環(huán),并可在數(shù)分鐘后迅速侵入肝細(xì)胞。經(jīng)短暫的紅外期增殖發(fā)育,裂殖子再次進(jìn)入血液循環(huán)、侵入紅細(xì)胞導(dǎo)致瘧疾臨床發(fā)作。
　　 疫苗是瘧疾防治的重要手段之一。雖然,瘧原蟲(chóng)紅外期感染不會(huì)引起患者出現(xiàn)臨床表現(xiàn)

2、,但是,阻斷紅外期瘧原蟲(chóng)的發(fā)育可以防止紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)的發(fā)育;另外,紅外期休眠子的存在也是間日瘧原蟲(chóng)患者復(fù)發(fā)的重要原因,因此,瘧原蟲(chóng)紅外期能從源頭控制瘧原蟲(chóng)的感染和防止瘧疾的復(fù)發(fā),是設(shè)計(jì)瘧疾亞單位疫苗的理想時(shí)期。
　　 迄今為止,最有保護(hù)性的紅外期疫苗是減毒子孢子疫苗,它能為宿主提供相對(duì)持久的保護(hù)性免疫。由于子孢子需要在蚊體內(nèi)發(fā)育,而且子孢子的減毒的程度不易控制,因此限制了減毒子孢子疫苗在實(shí)際中的應(yīng)用。然而,鑒于減毒子孢子疫苗能誘發(fā)

3、持久的保護(hù)性免疫,因此被作為研究有效肝期疫苗和篩選疫苗及候選抗原的重要模型。本研究建立了約氏瘧原蟲(chóng)265株減毒子孢子疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生完全保護(hù)性免疫小鼠模型,并初步探討了減毒子孢子疫苗的保護(hù)性效應(yīng)機(jī)制,為深入研究紅外期疫苗的保護(hù)性免疫機(jī)制和瘧疾亞單位疫苗的研制奠定了重要的基礎(chǔ)。
　　 一、構(gòu)建Real-time PCR紅外期瘧原蟲(chóng)檢測(cè)平臺(tái):比對(duì)已知不同種屬瘧原蟲(chóng)的A型18S rRNA的核苷酸序列,根據(jù)保守核苷酸序列設(shè)計(jì)瘧原蟲(chóng)特異的

4、18S rRNA引物,PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度約為839bp的目的片段。常規(guī)T/A克隆獲得P.y.BY265株18S rRNA序列,與約氏瘧原蟲(chóng)17XNL株相似性為98％。根據(jù)P.y.BY265株18S rRNA序列設(shè)計(jì)特異Real-time PCR引物和TaqMan探針,以小鼠GAPDH為內(nèi)參照,構(gòu)建P.y.BY265紅外期瘧原蟲(chóng)Real-time PCR檢測(cè)平臺(tái),結(jié)果顯示,構(gòu)建的Real-time PCR檢測(cè)平臺(tái)能夠檢測(cè)到最低為50個(gè)子孢

5、子劑量感染的小鼠肝臟蟲(chóng)荷。
　　 二、減毒子孢子誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生保護(hù)性免疫及其效應(yīng)機(jī)制:
　　 1、確定減毒子孢子輻照減毒最適合的劑量:采用8000rd和10000rd劑量的60Co室溫照射減毒約氏瘧原蟲(chóng)BY265株子孢子80 min后,以10000個(gè)/次尾靜脈注入小鼠,部分小鼠在瘧原蟲(chóng)感染后42h取出肝臟進(jìn)行Real-time PCR分析,部分小鼠在瘧原蟲(chóng)感染后4～14天內(nèi)進(jìn)行原蟲(chóng)血癥檢查。結(jié)果顯示,8000rd輻照組

6、感染小鼠能檢測(cè)到瘧原蟲(chóng)特異的18sUrRNA,而10000rd輻照組感染小鼠未能檢測(cè)到瘧原蟲(chóng)特異的18sUrRNA:一直到感染后14天,兩組感染小鼠均未檢測(cè)到紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng),因此,8,000rd應(yīng)該是比較合適的子孢子減毒輻照劑量。
　　 2、減毒子孢子免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生完全保護(hù)性免疫:末次免疫后14天,尾靜脈注射1,000個(gè)野生株子孢子攻擊感染減毒子孢子免疫小鼠和對(duì)照小鼠,攻擊后5～14天,吉氏染色常規(guī)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)紅內(nèi)期,發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照

7、組小鼠在第5天出現(xiàn)原蟲(chóng)血癥,第14天時(shí)原蟲(chóng)血癥達(dá)到10％以上;然而,減毒子孢子免疫小鼠在攻擊后14天均未查見(jiàn)紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng),說(shuō)明減毒子孢子免疫能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生完全保護(hù)性免疫。
　　 3、減毒子孢子免疫的保護(hù)性效應(yīng)機(jī)制的初探:末次免疫后30天,收集對(duì)照組小鼠和減毒子孢子免疫小鼠血清,采用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清中抗子孢子特異抗體的滴度。結(jié)果顯示,2只減毒子孢子免疫小鼠血清的抗子孢子抗體滴度分別為1:200和1:400:然而,正常對(duì)照組

8、小鼠血清在1:10稀釋度時(shí)無(wú)任何熒光反應(yīng),而減毒子孢子免疫小鼠血清均可與約氏瘧原蟲(chóng)BY265株子孢子發(fā)生特異熒光結(jié)合反應(yīng),且熒光點(diǎn)數(shù)量、亮度隨血清稀釋度增加而減少,提示減毒子孢子疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生子孢子特異抗體。
　　 末次免疫后45天,分離對(duì)照組和減毒子孢子免疫小鼠的肝臟淋巴細(xì)胞,CSP CD8+T細(xì)胞表位多肽SYVPSAEQ刺激18h后,檢測(cè)IFNI-γ的分泌情況,發(fā)現(xiàn)CSP CD8+T細(xì)胞表位多肽能有效的刺激免疫小鼠肝臟淋