NT1基因敲除的減毒伯氏瘧原蟲構(gòu)建及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、瘧疾是世界三大傳染病之一，以按蚊為傳播媒介，致病病原體是瘧原蟲。目前，32億人處在瘧疾威脅之下，其中95％的瘧疾死亡是由于惡性瘧原蟲感染導(dǎo)致的。肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率都位居癌癥新增發(fā)病和死亡率之首，傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療及其聯(lián)合療法由于各自的局限性在控制肺癌的發(fā)展已經(jīng)遇到很大的瓶頸，例如缺乏特異性，生物療法越來越受到重視。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，瘧原蟲通過廣泛激活機體的天然免疫系統(tǒng)和誘導(dǎo)一定的針對腫瘤的特異性抗原，

2、從而顯著地抑制小鼠Lewis肺癌的生長和延長荷瘤小鼠的生存期。但是瘧原蟲具有一定的毒副作用，我們擬對瘧原蟲進(jìn)行減毒，提高瘧原蟲治療肺癌的安全性。瘧原蟲本身沒有嘌呤的合成途徑，只能從宿主中獲得嘌呤堿或者嘌呤核苷，依賴補救合成途徑滿足瘧原蟲的裂體增殖需求。核苷轉(zhuǎn)運蛋白1(NT1)是瘧原蟲合成嘌呤途徑的一個關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)將嘌呤核苷和嘌呤堿基轉(zhuǎn)運到瘧原蟲的膜內(nèi)。在C57BL/6小鼠中Plasmodium berghei ANKA(P.b ANKA

3、)是致死性的鼠瘧原蟲株，Pb.ANKA感染C57BL/6小鼠是研究減毒瘧原蟲的最佳模型。
　　本研究首先構(gòu)建雙交換同源重組的質(zhì)粒載體pL0018-NT1，質(zhì)粒上含有GFP標(biāo)記基因和tgdhfr/ts抗性基因，使用電轉(zhuǎn)化方式將質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)P.b ANKA瘧原蟲中，經(jīng)過乙胺嘧啶藥篩，第一次單克隆化得到GFP表達(dá)和位點特異性整合的2個克隆8＃和9＃，其中8＃克隆經(jīng)過第二次單克隆化，得到穩(wěn)定NT1基因敲除和位點特異性整合的P.b ANKA-△

4、NT1-8C1克隆。觀察發(fā)現(xiàn)野生型P.b ANKA感染小鼠后小鼠很快全部死亡，NT1敲除的P.b ANKA-△NT1蟲株在接種C57BL/6小鼠后，能形成高達(dá)85％的感染率的原蟲血癥，感染周期能達(dá)到80天，6只感染的小鼠有5只不死亡，總體生存期顯著延長。在P.bANKA-△NT1感染小鼠38天時間里，在100倍油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)配子體數(shù)顯著降低，每100個白細(xì)胞最高只能觀察到48個配子體，在接種2～18天內(nèi)，配子體數(shù)在0～25個數(shù)量范圍內(nèi)波

5、動，遠(yuǎn)低于野生型最多時400個配子體的水平。瘧原蟲的配子體數(shù)目的降低有利于阻斷瘧原蟲在按蚊體內(nèi)的有性生殖，是藥物減毒和輻照減毒策略所不具有的安全性優(yōu)勢，避免瘧原蟲通過按蚊在人群中大量傳播。NT1基因敲除的P.b ANKA-△NT1蟲株顯著降低瘧原蟲對小鼠的毒副作用，從致死型蟲株轉(zhuǎn)變?yōu)榉侵滤佬韵x株，具有更長的感染周期，同時顯著降低外周血中的配子體，提供了更加有效和安全的減毒瘧原蟲，可以作為肺癌疫苗的腫瘤抗原表達(dá)載體，為腫瘤的生物免疫治療提