伯氏瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白N端和N+C端與肝細胞靶向性作用的研究.pdf

1、瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白（Circumsporozoite protein，CSP）是瘧原蟲在子孢子階段表達的一個重要蛋白質(zhì)，均勻分布于整個子孢子表面。CSP主要由3個部分組成：含信號肽和I區(qū)的N端、中央重復(fù)區(qū)以及含有錨狀序列和II區(qū)的C端。中央重復(fù)區(qū)是主要免疫顯性位點，富含B細胞表位。CSP是目前瘧疾疫苗及其診斷的重要候選分子之一。
　　當含有瘧原蟲子孢子的雌性按蚊刺吸中間宿主（如人和其他哺乳動物等）血時，子孢子隨唾液進入機體，約經(jīng)3

2、0min即可入侵肝細胞，其速度和選擇性提示在該過程中存在配體-受體介導的入侵機制。研究表明瘧原蟲CSP作為主要分子參與了該過程。肝細胞與CSP結(jié)合的主要受體是肝細胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs），其中GAG是CSP的結(jié)合位點。以惡性瘧原蟲為例，CSP的N端（aa82-aa100）和C端（aa328-aa346）等片段可特異與肝細胞的HSPGs相結(jié)合。CSP作為配體可與肝細胞受體結(jié)合，故其具有成為肝細胞靶向藥物分子的潛力。鑒于完

3、整的CSP免疫原性較強，若作為藥物靶向分子，可誘導較強的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的抗體能抑制CSP與受體的結(jié)合。因此，即要保留CSP靶向結(jié)合的能力，又要降低其免疫原性，才能符合藥物靶向分子的要求。
　　研究目的：
　　本研究根據(jù)小鼠伯氏瘧原蟲（Plasmodium berghei，P.b）的CSP表位分析，將富含T、B細胞表位的中央重復(fù)區(qū)去除，保留含極少量表位的N和C端，以降低其免疫原性。針對伯氏瘧原蟲CSP-N端和N+C端分別進行克

4、隆、原核表達及重組蛋白純化；在體外，通過Pull Down檢測兩種重組蛋白與肝細胞膜HSPGs分子結(jié)合的能力，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用免疫組化方法進一步觀察兩種蛋白是否與小鼠肝細胞膜特異結(jié)合；在體內(nèi)，通過放射性元素標記示蹤，檢測兩種重組蛋白在小鼠體內(nèi)靶向肝組織的特異性，為進一步研究該蛋白能否作為肝細胞藥物靶向性分子奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　1．構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-PbCSP-N和pET32a-PbCSP-N+C，表達并純化

5、重組蛋白提取伯氏瘧原蟲基因組DNA，根據(jù)已知的PbCSP基因全長序列設(shè)計特異性引物，以全基因組DNA為模板行PCR擴增，將產(chǎn)物克隆入質(zhì)粒，繼而以構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒為模板擴增N端和C端基因片段，將產(chǎn)物定向克隆至原核表達載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-PbCSP-N和pET32a-PbCSP-N+C。將兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，進行IPTG誘導表達，用親和層析技術(shù)純化目的蛋白，行SDS-PAGE分析和Western-blot鑒

6、定。
　　2．體外觀察PbCSP-N和PbCSP-N+C重組蛋白與小鼠肝細胞特異結(jié)合應(yīng)用Pull Down方法，檢測PbCSP-N和PbCSP-N+C重組蛋白與肝細胞膜蛋白HSPGs的結(jié)合能力。取正常小鼠新鮮的肝臟、肺、心臟、脾、腎臟、胃竇部、小腸、子宮、腸系膜淋巴結(jié)制備組織切片，應(yīng)用免疫組化方法，觀察PbCSP-N、PbCSP-N+C重組蛋白與肝細胞膜結(jié)合的特異性。
　　3．體內(nèi)觀察PbCSP-N和PbCSP-N+C重組蛋

7、白靶向小鼠肝組織應(yīng)用Na125I標記PbCSP-N、 PbCSP-N+C重組蛋白和Trx蛋白，將純化的標記產(chǎn)物通過尾靜脈注射入正常小鼠體內(nèi)，分別于注射后1h、2h、4h、6h、12h觀察 PbCSP-N和PbCSP-N+C重組蛋白在小鼠肝臟、心臟、肺、腎臟、脾、小腸、血液中的動態(tài)分布。
　　研究結(jié)果：
　　1．成功構(gòu)建pET28a-PbCSP-N和pET32a-PbCSP-N+C重組質(zhì)粒，表達并純化重組蛋白以P.berghe

8、i基因組 DNA為模板擴增出 PbCSP全長基因，約1000bp。將PbCSP全長基因克隆入pET28a(+)載體，構(gòu)建pET28a-PbCSP克隆。經(jīng)過PCR和雙酶切鑒定、測序結(jié)果分析，表明成功構(gòu)建了pET28a-PbCSP載體。以該質(zhì)粒為模板特異性擴增出PbCSP的N和C端片段，大小約280bp和310bp。將擴增產(chǎn)物分別定向克隆入 pET28a載體(+)，成功構(gòu)建了pET28a-PbCSP-N和pET28a-PbCSP-C。pET

9、28a-PbCSP-C經(jīng) SalI和XhoI酶切后，切下的PbCSP-C片段，定向克隆入 pET28a-PbCSP-N重組質(zhì)粒的SalI酶切位點下游，成功構(gòu)建pET28a-PbCSP-N+C原核表達載體。因pET28a-PbCSP-N+C在BL21菌中經(jīng)IPTG誘導不表達重組蛋白，遂將其亞克隆入pET32a。
　　構(gòu)建的pET28a-PbCSP-N和pET32a-PbCSP-N+C重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化入BL21中進行原核表達，SDS

10、-PAGE結(jié)果顯示重組蛋白條帶大小與理論值符合（PbCSP-N為15kDa、PbCSP-N+C為39kDa）。pET28a-PbCSP-N重組蛋白主要存在于包涵體中，經(jīng)8M尿素變性后應(yīng)用親和層析進行純化，獲得的純化蛋白再經(jīng)梯度透析進行透析。pET32a-PbCSP-N+C重組蛋白為可溶性表達，經(jīng)純化后可直接獲得純度較高的目的蛋白。Western-blot結(jié)果顯示，純化的重組蛋白PbCSP-N和PbCSP-N+C可分別被抗His抗體和抗重

11、組蛋白PbCSP-N多克隆抗體識別。
　　2.體外PbCSP-N和PbCSP-N+C重組蛋白與小鼠肝細胞特異結(jié)合重組蛋白 PbCSP-N和PbCSP-N+C、Trx蛋白分別與小鼠肝細胞膜蛋白、His·Bind樹脂混合，反復(fù)漂洗后，將混合物行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，分別以抗His和抗HSPG抗體進行識別。結(jié)果表明PbCSP-N和PbCSP-N+C重組蛋白均能與肝細胞表面的HSPGs結(jié)合。
　　小鼠各組織冰凍切片免疫組化實驗

12、結(jié)果顯示，以大鼠抗 PbCSP-N重組蛋白的多克隆抗體為一抗時，在肝細胞上可見陽性棕黃色顆粒，而以正常大鼠血清為一抗，則未見該現(xiàn)象。在腎、胃、淋巴結(jié)、脾、心臟、小腸、肺、子宮組織切片，以PbCSP-N多克隆抗體和正常大鼠血清分別作為一抗時，在上述組織切片均未見陽性反應(yīng)。純化的Trx與各組織切片孵育后，以抗His抗體為一抗時，未見陽性反應(yīng)。后用同樣的方法行肝臟組織石蠟切片免疫組化，于肝細胞膜上可見棕黃色顆粒。結(jié)果表明PbCSP-N和PbC

13、SP-N+C重組蛋白在體外可特異結(jié)合小鼠肝細胞膜。
　　3．Na125I標記的PbCSP-N和PbCSP-N+C重組蛋白靶向小鼠肝組織Na125I成功標記PbCSP-N、 PbCSP-N+C重組蛋白和Trx蛋白，放射性活度分別為9.01mCi/ml、13.96mCi/ml、6.76mCi/ml。上述三種蛋白和Na125I溶液以相同的放射量分別經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示放射性 PbCSP-N重組蛋白在注射1h、2h、4h、6h

14、、12h后于脾和肝臟中分布較多；PbCSP-N+C重組蛋白則于各時間段均在肝臟分布最多，具有特異靶向肝組織的特性。
　　研究結(jié)論：
　　1．成功構(gòu)建了pET28a-PbCSP-N和pET32a-PbCSP-N+C原核表達載體，表達并純化了PbCSP-N和PbCSP-N+C重組蛋白。
　　2．在體外，PbCSP-N和PbCSP-N+C重組蛋白可與小鼠肝細胞表面的HSPGs分子結(jié)合，且與小鼠肝細胞膜特異結(jié)合。
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