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文檔簡介
1、蚊媒傳播的瘧疾是一種危害嚴重的熱帶傳染病,在全世界人群中具有很高的發(fā)病率和致死率。近年來瘧原蟲多藥抗性株的出現(xiàn)與迅速擴散,以及蚊媒對殺蟲劑耐受性的增加,目前又無有效的抗瘧疫苗,給瘧疾防治工作帶來很大的困難。傳統(tǒng)方法已難于控制該病的流行,迫切需要為瘧疾的防治工作提供新的方法和手段。瘧疾是由蚊蟲叮咬而傳播,瘧原蟲子孢子一旦進入血循環(huán),數(shù)分鐘后便隨血流跨過肝血竇枯否氏細胞(Kuppfercell,KC)后主動粘附、迅速侵入肝細胞,并進行紅外期
2、增殖,然后才侵入紅細胞,導致瘧疾的發(fā)作。子孢子侵入肝細胞是瘧疾感染的關鍵,而阻斷蟲體的侵入,即可防止瘧疾感染,紅外期阻斷疫苗旨在阻斷子孢子侵入宿主肝細胞,防止瘧原蟲紅內(nèi)期的發(fā)育,是瘧疾疫苗的重要組成部分。唾液腺子孢子感染性受發(fā)育調(diào)節(jié),正常情況下,中腸內(nèi)卵囊成熟后破裂,子孢子逸出,經(jīng)血淋巴移行到唾液腺后2d,發(fā)育成為具有感染性的子孢子。因此研究瘧原蟲具有侵入肝細胞能力的唾液腺子孢子與不具侵入肝細胞能力的卵囊子孢子之間的差異分子具有重要意義
3、。但現(xiàn)有的實驗技術尚不支持從媒介蚊的中腸和唾液腺中分離獲得高純度、足量的子孢子,因此針對這個時期的研究工作存在較大難度。 已經(jīng)完成的惡性瘧原蟲、其媒介岡比亞按蚊和約氏瘧原蟲全基因組測序工作,以及其他種類瘧原蟲(間日瘧原蟲、伯氏瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、雞瘧原蟲)大量基因組序列的獲得,為后續(xù)的瘧原蟲研究打下了堅實基礎,基因功能的分析和蛋白質(zhì)組學研究已成為后基因組時代的主要任務。通過對瘧原蟲子孢子肝細胞侵入相關的差異基因和蛋白的大量發(fā)現(xiàn)和
4、鑒定,將有助于認識瘧原蟲生長發(fā)育的分子機制,可為瘧疾的防治提供分子理論依據(jù),提供藥物和疫苗新的靶目標,為采取防治策略戰(zhàn)勝瘧疾打下了堅實的基礎。 因此本實驗以斯氏按蚊-約氏瘧原蟲為模型,從基因和蛋白兩方面對子孢子侵入肝細胞相關分子進行研究,實驗內(nèi)容和結(jié)果: 1.已知瘧原蟲基因的A+T含量在80%以上,而蚊基因組A+T僅為40~50%。因此,本實驗通過改變常規(guī)DD-PCR中引物的G+C含量,設計能從蚊組織和瘧原蟲混存樣本中特
5、異擴增瘧原蟲基因的A+T含量60%的引物,與DD-PCR技術相結(jié)合,繞過了純化子孢子的技術屏障,特異擴增瘧原蟲基因,富集唾液腺子孢子和卵囊子孢子差異cDNA。試驗中得到PyDg1~3(Plasmodiumyoeliidifferentialgene1~3)差異基因均為瘧原蟲來源的基因,表明我們采用的方法能夠特異擴增瘧原蟲基因,排除蚊背景的污染。將得到的核酸序列登陸GenBank數(shù)據(jù)庫,通過Blast查詢相似性序列,并進行序列比對和分析,
6、PyDg1大小為263bp,與已知的伯氏瘧原蟲唾液腺子孢子uis16-1基因序列同源性達86%(186/215);PyDg2大小為517bp,與已知的伯氏瘧原蟲唾液腺子孢子微線體SPECT基因序列同源性達74%(241/325);PyDg3大小為244bp,已知的具有MACPF相關域的伯氏瘧原蟲唾液腺子孢子SPECT2基因序列同源性達92%(226/244)。我們獲得的三個差異基因可能參與了唾液腺子孢子對肝細胞的侵入、發(fā)育為紅細胞外期(
7、exo-erythrocyticforms,EEF)的過程,為進一步研究子孢子成熟過程中感染性形成的分子機制奠定了基礎。 2.在瘧原蟲卵囊子孢子發(fā)育為具有侵入肝細胞能力的唾液腺子孢子后,子孢子能通過受體-配體作用方式入侵宿主肝細胞,其發(fā)育過程涉及多種子孢子蛋白分子,進行的是整個細胞水平上以及與宿主肝細胞相互作用的改變。只有進行系統(tǒng)性、整合性的基因或蛋白水平的研究,才能充分闡明子孢子的侵入機制。因此我們采用2-DE技術來研究具有侵
8、入肝細胞能力的唾液腺子孢子和不具有侵入肝細胞能力的卵囊子孢子之間的差異表達蛋白,并通過MALDI-TOF-MS和PMF進行初步分析鑒定,找出侵入相關蛋白。推測這些蛋白可能與瘧原蟲子孢子黏附、侵入肝細胞相關,可能為新的阻斷策略和瘧疾多價亞單位疫苗的靶目標。同時發(fā)現(xiàn)的一個來源于蚊組織的差異蛋白PyDp6(pI約為pH3.5,MW約為36.5×103)與ENSANGP00000022306(Anophelesgambiae)相匹配,提示在瘧原
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