約氏瘧原蟲子孢子侵入肝細(xì)胞相關(guān)基因及蛋白研究.pdf

1、蚊媒傳播的瘧疾是一種危害嚴(yán)重的熱帶傳染病，在全世界人群中具有很高的發(fā)病率和致死率。近年來(lái)瘧原蟲多藥抗性株的出現(xiàn)與迅速擴(kuò)散，以及蚊媒對(duì)殺蟲劑耐受性的增加，目前又無(wú)有效的抗瘧疫苗，給瘧疾防治工作帶來(lái)很大的困難。傳統(tǒng)方法已難于控制該病的流行，迫切需要為瘧疾的防治工作提供新的方法和手段。瘧疾是由蚊蟲叮咬而傳播，瘧原蟲子孢子一旦進(jìn)入血循環(huán)，數(shù)分鐘后便隨血流跨過(guò)肝血竇枯否氏細(xì)胞(Kuppfercell，KC)后主動(dòng)粘附、迅速侵入肝細(xì)胞，并進(jìn)行紅外期

2、增殖，然后才侵入紅細(xì)胞，導(dǎo)致瘧疾的發(fā)作。子孢子侵入肝細(xì)胞是瘧疾感染的關(guān)鍵，而阻斷蟲體的侵入，即可防止瘧疾感染，紅外期阻斷疫苗旨在阻斷子孢子侵入宿主肝細(xì)胞，防止瘧原蟲紅內(nèi)期的發(fā)育，是瘧疾疫苗的重要組成部分。唾液腺子孢子感染性受發(fā)育調(diào)節(jié)，正常情況下，中腸內(nèi)卵囊成熟后破裂，子孢子逸出，經(jīng)血淋巴移行到唾液腺后2d，發(fā)育成為具有感染性的子孢子。因此研究瘧原蟲具有侵入肝細(xì)胞能力的唾液腺子孢子與不具侵入肝細(xì)胞能力的卵囊子孢子之間的差異分子具有重要意義

3、。但現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)技術(shù)尚不支持從媒介蚊的中腸和唾液腺中分離獲得高純度、足量的子孢子，因此針對(duì)這個(gè)時(shí)期的研究工作存在較大難度。 已經(jīng)完成的惡性瘧原蟲、其媒介岡比亞按蚊和約氏瘧原蟲全基因組測(cè)序工作，以及其他種類瘧原蟲(間日瘧原蟲、伯氏瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、雞瘧原蟲)大量基因組序列的獲得，為后續(xù)的瘧原蟲研究打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，基因功能的分析和蛋白質(zhì)組學(xué)研究已成為后基因組時(shí)代的主要任務(wù)。通過(guò)對(duì)瘧原蟲子孢子肝細(xì)胞侵入相關(guān)的差異基因和蛋白的大量發(fā)現(xiàn)和

4、鑒定，將有助于認(rèn)識(shí)瘧原蟲生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制，可為瘧疾的防治提供分子理論依據(jù)，提供藥物和疫苗新的靶目標(biāo)，為采取防治策略戰(zhàn)勝瘧疾打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 因此本實(shí)驗(yàn)以斯氏按蚊-約氏瘧原蟲為模型，從基因和蛋白兩方面對(duì)子孢子侵入肝細(xì)胞相關(guān)分子進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果： 1.已知瘧原蟲基因的A+T含量在80％以上，而蚊基因組A+T僅為40～50％。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變常規(guī)DD-PCR中引物的G+C含量，設(shè)計(jì)能從蚊組織和瘧原蟲混存樣本中特

5、異擴(kuò)增瘧原蟲基因的A+T含量60％的引物，與DD-PCR技術(shù)相結(jié)合，繞過(guò)了純化子孢子的技術(shù)屏障，特異擴(kuò)增瘧原蟲基因，富集唾液腺子孢子和卵囊子孢子差異cDNA。試驗(yàn)中得到PyDg1～3(Plasmodiumyoeliidifferentialgene1～3)差異基因均為瘧原蟲來(lái)源的基因，表明我們采用的方法能夠特異擴(kuò)增瘧原蟲基因，排除蚊背景的污染。將得到的核酸序列登陸GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)Blast查詢相似性序列，并進(jìn)行序列比對(duì)和分析，

6、PyDg1大小為263bp，與已知的伯氏瘧原蟲唾液腺子孢子uis16-1基因序列同源性達(dá)86％(186/215)；PyDg2大小為517bp，與已知的伯氏瘧原蟲唾液腺子孢子微線體SPECT基因序列同源性達(dá)74％(241/325)；PyDg3大小為244bp，已知的具有MACPF相關(guān)域的伯氏瘧原蟲唾液腺子孢子SPECT2基因序列同源性達(dá)92％(226/244)。我們獲得的三個(gè)差異基因可能參與了唾液腺子孢子對(duì)肝細(xì)胞的侵入、發(fā)育為紅細(xì)胞外期(

7、exo-erythrocyticforms，EEF)的過(guò)程，為進(jìn)一步研究子孢子成熟過(guò)程中感染性形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 2.在瘧原蟲卵囊子孢子發(fā)育為具有侵入肝細(xì)胞能力的唾液腺子孢子后，子孢子能通過(guò)受體-配體作用方式入侵宿主肝細(xì)胞，其發(fā)育過(guò)程涉及多種子孢子蛋白分子，進(jìn)行的是整個(gè)細(xì)胞水平上以及與宿主肝細(xì)胞相互作用的改變。只有進(jìn)行系統(tǒng)性、整合性的基因或蛋白水平的研究，才能充分闡明子孢子的侵入機(jī)制。因此我們采用2-DE技術(shù)來(lái)研究具有侵

8、入肝細(xì)胞能力的唾液腺子孢子和不具有侵入肝細(xì)胞能力的卵囊子孢子之間的差異表達(dá)蛋白，并通過(guò)MALDI-TOF-MS和PMF進(jìn)行初步分析鑒定，找出侵入相關(guān)蛋白。推測(cè)這些蛋白可能與瘧原蟲子孢子黏附、侵入肝細(xì)胞相關(guān)，可能為新的阻斷策略和瘧疾多價(jià)亞單位疫苗的靶目標(biāo)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)來(lái)源于蚊組織的差異蛋白PyDp6(pI約為pH3.5，MW約為36.5×103)與ENSANGP00000022306(Anophelesgambiae)相匹配，提示在瘧原