NO抵制并瘧原蟲(chóng)裂殖子侵入紅細(xì)胞相關(guān)分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 瘧疾是瘧原蟲(chóng)通過(guò)媒介昆蟲(chóng)蚊傳播的人類最為嚴(yán)重的寄生原蟲(chóng)感染性疾病?！禢ature》公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，世界上100多個(gè)國(guó)家為瘧疾流行區(qū)，約22億人口受到瘧疾威脅，每年有300～500萬(wàn)瘧疾臨床病例，病死人數(shù)高達(dá)110～270萬(wàn)。為此，瘧疾的廣泛流行給全球尤其是發(fā)展中國(guó)家?guī)?lái)了沉痛的健康危害和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。瘧疾發(fā)病主要源于瘧原蟲(chóng)在宿主紅細(xì)胞內(nèi)的裂體增殖，而阻斷瘧原蟲(chóng)對(duì)紅細(xì)胞的侵入是控制瘧疾發(fā)病的關(guān)鍵因素。

2、>　　 瘧原蟲(chóng)要完成在宿主體內(nèi)紅內(nèi)期的發(fā)育，必須通過(guò)自身的配體識(shí)別宿主紅細(xì)胞上的相應(yīng)受體，從而完成侵入的過(guò)程。因此，瘧原蟲(chóng)表達(dá)的配體分子和相應(yīng)紅細(xì)胞的受體之間的相互作用是瘧原蟲(chóng)侵入過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。雖然不同種屬的瘧原蟲(chóng)入侵不同發(fā)育階段的宿主紅細(xì)胞(如:間日瘧原蟲(chóng)(Plasmodium vivax，Pv)入侵網(wǎng)織紅細(xì)胞，卵形瘧原蟲(chóng)(Plasmodium ovale，Po)入侵成熟的紅細(xì)胞，而惡性瘧原蟲(chóng)（Plasmodium falcip

3、arum，Pf）可入侵所有發(fā)育階段的紅細(xì)胞），但是各種屬瘧原蟲(chóng)均具有相同的形態(tài)學(xué)特征和胞漿內(nèi)器官。這一相似的結(jié)構(gòu)學(xué)特征提示，入侵過(guò)程中所需的分子機(jī)制可能相同。
　　 近年來(lái)，隨著瘧原蟲(chóng)-紅細(xì)胞相互作用分子機(jī)制研究的深入進(jìn)行，如裂殖子表面蛋白1(Merozoite surface protein-1，MSP-1)、頂端膜抗原1(Apical MembraneAntigen-1，AMA-1)等在侵入過(guò)程中發(fā)揮重要作用的分子，其結(jié)構(gòu)和

4、功能已逐漸明確，相應(yīng)的瘧疾疫苗也已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)階段。此外，對(duì)裂殖子頂端復(fù)合體（一種在原蟲(chóng)入侵過(guò)程中發(fā)揮重要作用的頂端結(jié)構(gòu)）的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，其組成成分之一的棒狀體(Rhoptry)在入侵過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。棒狀體由多種蛋白分子組成，是介導(dǎo)瘧原蟲(chóng)納蟲(chóng)空泡(Parasitophorous vacuole，PV)形成的重要結(jié)構(gòu)。惡性瘧原蟲(chóng)棒狀體中大分子蛋白R(shí)hopH復(fù)合體組成分子分別為RhopH1(155kDa)、RhopH2(140k

5、Da)和RhopH3(110kDa)。約氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumyoelii，Py) RhopH復(fù)合體依照其惡性瘧原蟲(chóng)同系物分別被命名為PyRhopH1A(135kDa)、PyRhopH2(140kDa)和PyRhopH3(100kDa)。眾所周知，體現(xiàn)瘧原蟲(chóng)毒力不同的一個(gè)鮮明特點(diǎn)是其裂殖子識(shí)別和入侵宿主紅細(xì)胞的發(fā)育階段不同，近年研究發(fā)現(xiàn)此種選擇性識(shí)別入侵機(jī)制與棒狀體各組成蛋白間關(guān)系密切。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察均發(fā)現(xiàn)，抗RhopH復(fù)合體的

6、特異性抗體可抑制瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育。利用基因敲除技術(shù)對(duì)瘧原蟲(chóng)的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲(chóng)PfRhoph3基因敲除的瘧原蟲(chóng)無(wú)法存活，提示RhopH complex賦予了瘧原蟲(chóng)重要的生物學(xué)作用。Preiser等人也報(bào)道約氏瘧原蟲(chóng)棒狀體內(nèi)另一種分子量為235kDa(Py235)的蛋白與裂殖子對(duì)紅細(xì)胞的粘附及致病力顯著相關(guān)，基因組分別定位于約氏瘧原蟲(chóng)第1、5、6和10號(hào)染色體的亞端粒區(qū)。Py235與間日瘧原蟲(chóng)網(wǎng)織紅細(xì)胞粘連蛋白2(RBP-2)、惡性

7、瘧原蟲(chóng)紅細(xì)胞粘連蛋白PfRBP2-Ha和PfRBP2-Hb的基因結(jié)構(gòu)高度近似。蛋白功能分析顯示，抗Py235蛋白的單克隆抗體可改變致死性YM株（可感染所有發(fā)育階段的瘧原蟲(chóng)）的感染模式，使其與自限性17X株（只感染網(wǎng)織紅細(xì)胞）的感染模式相同。這些結(jié)果進(jìn)一步提示RhopH復(fù)合體和Py235各家族成員與裂殖子表面分子MSP-1和AMA-1共同參與瘧原蟲(chóng)-紅細(xì)胞粘附機(jī)制，并在瘧原蟲(chóng)入侵宿主紅細(xì)胞中發(fā)揮重要的選擇性作用。
　　 不斷積累的

8、研究數(shù)據(jù)表明:瘧原蟲(chóng)感染早期有效的Th1型免疫應(yīng)答的建立，在遏制瘧原蟲(chóng)的裂體增殖和介導(dǎo)瘧疾感染結(jié)局方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。一氧化氮(NO)作為T(mén)h1型免疫應(yīng)答的效應(yīng)分子，在免疫防御中具有不可忽視的作用地位。NO由L-精氨酸在轉(zhuǎn)變成胍氨酸過(guò)程中經(jīng)一氧化氮合酶(NOS)催化形成，可由機(jī)體的多種組織細(xì)胞產(chǎn)生。其中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS或NOS2）誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO在抗腫瘤發(fā)生、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抗菌、抗病毒及胞內(nèi)寄生性原蟲(chóng)等多種病原生物感染

9、過(guò)程中，發(fā)揮著重要的免疫防御作用。瘧原蟲(chóng)紅外期研究結(jié)果顯示，NO可明顯消除瘧原蟲(chóng)子孢子對(duì)肝細(xì)胞的感染。我們前期的蚊階段研究觀察發(fā)現(xiàn)，約氏瘧原蟲(chóng)感染早期自然傳播阻斷現(xiàn)象的出現(xiàn)不是發(fā)生在蚊體內(nèi)，而是發(fā)生于感染宿主體內(nèi)，并且與宿主NO產(chǎn)生密切相關(guān)。NO可直接抑制配子體向配子的進(jìn)一步發(fā)育。然而，與肝內(nèi)期和蚊階段相比，NO在抗紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)免疫機(jī)制中的作用尚未清楚。一些學(xué)者認(rèn)為NO是控制和消除紅內(nèi)期蟲(chóng)體血癥的重要免疫效應(yīng)分子。iNOS產(chǎn)生增加與感染

10、小鼠存活時(shí)間延長(zhǎng)密切相關(guān)，惡性瘧原蟲(chóng)感染過(guò)程中，無(wú)并發(fā)癥瘧疾患者外周血iNOS mRNA水平顯著升高且單核細(xì)胞數(shù)量增加;同時(shí)，NO還可通過(guò)抑制感染惡性瘧原蟲(chóng)的紅細(xì)胞對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附保護(hù)易感宿主;應(yīng)用NO發(fā)生劑進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)也顯示，NO通過(guò)細(xì)胞毒效應(yīng)可明顯抑制夏氏瘧原蟲(chóng)、柏氏瘧原蟲(chóng)和惡性瘧原蟲(chóng)紅內(nèi)期原蟲(chóng)的生長(zhǎng)及發(fā)育。然而，也有結(jié)果顯示:應(yīng)用iNOS抑制劑氨基胍(AG)治療后，夏氏瘧原蟲(chóng)感染小鼠的蟲(chóng)體血癥水平和存活時(shí)間并未出現(xiàn)明顯的變

11、化;用痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的NO或注射NOS抑制劑，小鼠的蟲(chóng)體血癥水平也未見(jiàn)有意義的改變。提示NO水平的升高并不足以清除紅內(nèi)期感染。然而，某些學(xué)者認(rèn)為NO之所以不能有效殺傷紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)（環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體），可能是NO在紅細(xì)胞內(nèi)彌散過(guò)程中被血紅蛋白耗竭，因而到達(dá)瘧原蟲(chóng)體的有效NO濃度降低，不能發(fā)揮其非特異性殺傷效應(yīng)。而裂殖子是瘧原蟲(chóng)唯一不被宿主紅細(xì)胞保護(hù)、完全裸露于宿主免疫系統(tǒng)之下，易受效應(yīng)分子攻擊的發(fā)育階段。因此，深

12、入探討NO在紅內(nèi)期保護(hù)性免疫應(yīng)答中的作用地位，特別是闡明NO介導(dǎo)裂殖子與紅細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。
　　 關(guān)于NO介導(dǎo)瘧原蟲(chóng)侵入宿主紅細(xì)胞的分子機(jī)制至今尚無(wú)報(bào)道。為此，本研究是在上述系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，擬利用我們成功建立的Py17XL易感和抵抗鼠瘧模型，通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)紅細(xì)胞感染率、利用NO合成前體物質(zhì)L-精氨酸干預(yù)兩種鼠瘧模型免疫應(yīng)答特點(diǎn)及效應(yīng);體內(nèi)、外監(jiān)測(cè)NO產(chǎn)生水平變化對(duì)PyMSP1-19、PyAMA-1、Py

13、RhopH復(fù)合體和Py235轉(zhuǎn)錄和表達(dá)模式及其介導(dǎo)瘧原蟲(chóng)粘附機(jī)制的影響，以及在瘧原蟲(chóng)感染周期中Py235表達(dá)變異體的種類和其表達(dá)模式。進(jìn)一步確定裂殖子侵入紅細(xì)胞的分子機(jī)制，以期為探討控制瘧疾發(fā)病的免疫治療提供新的作用靶位，同時(shí)為開(kāi)發(fā)高效的瘧疾發(fā)病阻斷疫苗提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染及其模型建立
　　 6-8周齡、雌性DBA/2和BALB/c小鼠，經(jīng)腹腔分別感染1×106 P.

14、y17XL寄生的紅細(xì)胞(pRBC)，構(gòu)建不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。感染不同時(shí)間的小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。L-精氨酸體內(nèi)處理組小鼠實(shí)驗(yàn)組于瘧原蟲(chóng)感染前連續(xù)口服給予L-Arg(1.5g/kg BW)7d，對(duì)照組在感染前同樣時(shí)間點(diǎn)給予同體積生理鹽水。一氧化氮發(fā)生劑配置，用無(wú)菌1×PBS配制25mmol/LNOC18，2.5 mmol/LNOC18，100 mmol/LNOC5和25 mmol/LNOC5

15、，長(zhǎng)效發(fā)生劑NOC18于小鼠感染后第2天尾靜脈注射，100ul/次/日，短效發(fā)生劑NOC5于感染后6d腹腔注射100ul/只，孵育30min;用RPMI-1640含小牛血清培養(yǎng)液配制1.25mmol/L,2.5 mmol/L，5mmol/L和10 mmol/LNOC5短效一氧化氮發(fā)生劑用于體外實(shí)驗(yàn)，37℃，5％CO2，孵育30min。
　　 2、瘧原蟲(chóng)成熟裂殖體純化
　　 肝素抗凝，心臟采集感染后第6d小鼠血液(紅細(xì)胞感

16、染率達(dá)60％～80％)，經(jīng)滅菌纖維素(CF)11過(guò)柱，去除白細(xì)胞，50％ Percoll密度離心法進(jìn)一步分離、收集瘧原蟲(chóng)裂殖體。
　　 3、脾細(xì)胞培養(yǎng)及樹(shù)突細(xì)胞(DCs)的純化
　　 無(wú)菌取出感染小鼠脾臟，制成細(xì)胞懸液并調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/ml，24孔培養(yǎng)板上加入細(xì)胞懸液，500ul/孔，于37℃培養(yǎng)48h。350g室溫離心10min，收集上清，-80℃保存，待IFN-γ和NO檢測(cè)。按照小鼠DCs純化試劑盒說(shuō)明

17、書(shū)所示，從小鼠脾細(xì)胞懸液中陰性選擇純化脾DCs。將脾DCs終濃度調(diào)整為1×106/ml，于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入500ul，培養(yǎng)48h后，收集培養(yǎng)上清，-80℃保存，待IL-12p40檢測(cè)。
　　 4、采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)小鼠感染瘧原蟲(chóng)后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和樹(shù)突細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12p40的含量
　　 用雙抗體夾心ELISA法對(duì)IFN-γ和IL-12p40含量進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處OD值，

18、應(yīng)用SoftMaxPro4.3.1 LS軟件分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　 5、NO2-測(cè)定
　　 Griess方法檢測(cè)經(jīng)培養(yǎng)48h脾細(xì)胞上清中NO2-水平。計(jì)算其含量(μM)。
　　 6、流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)L-Arg體內(nèi)干預(yù)小鼠感染瘧原蟲(chóng)后，脾樹(shù)突細(xì)胞亞群及巨噬細(xì)胞活化情況
　　 (1)每份樣品用抗-CD11 c-FITC單克隆抗體、抗-CD111b-PE單克隆抗體和

19、抗-B220-Percp單克隆抗體進(jìn)行三色分析，另設(shè)陰性對(duì)照管。預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1ml，再加入抗-CD11 c-FITC單克隆抗體、抗-CD11b-PE單克隆抗體和抗-B220-PerCP單克隆抗體進(jìn)行表面染色。離心去上清后，洗滌兩次，靜置15min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
　　 (2)每份樣品用抗-F4/80-FITC單克隆抗體和抗-CD36-PE單克隆抗體進(jìn)行雙色分析，另設(shè)

20、陰性對(duì)照管。預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1ml，再加入抗-F4/80-FITC單克隆抗體和抗-CD36-PE單克隆抗體進(jìn)行表面染色。離心去上清后，洗滌兩次，靜置15min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
　　 7、實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)侵襲相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平
　　 (1) PCR引物利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5設(shè)計(jì)約氏瘧原蟲(chóng)MSP-1、AMA-1、RhopH復(fù)合體、Py235家族以

21、及β-actin的特異性引物。
　　 (2) Real-time RT PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平差異:按照TAKARA熒光法Real-timePCR兩步法試劑盒說(shuō)明書(shū)，合成cDNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。利用相對(duì)定量法檢測(cè)PyMSP1-19、PyAMA-1、PyRhopH2復(fù)合體和11個(gè)py235基因家族成員的轉(zhuǎn)錄水平，t檢驗(yàn)比較轉(zhuǎn)錄水平的差異。
　　 8、Western blotting對(duì)比檢測(cè)侵襲相關(guān)分子的翻譯水平

22、>　　 將裂殖體在100ul含有蛋白酶抑制劑的磷酸鹽緩沖液中-80℃凍融3次，每次冷凍時(shí)間30min，在10％ Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)中分離蛋白。分別應(yīng)用抗PyAMA-1、PyRhopH復(fù)合體作為一抗，二抗用羊抗小鼠或羊抗兔HRP熒光抗體，ECL發(fā)光法檢測(cè)相應(yīng)蛋白表達(dá)水平。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、P.y17XL感染DBA/2和BALB/c小鼠后不同時(shí)間脾臟DCs亞群的數(shù)量

23、>　　 BALB/c和DBA/2小鼠脾臟髓樣樹(shù)突細(xì)胞(CD11 c+CD11b+DCs)的數(shù)量于感染后3、5d均明顯升高，并且DBA/2小鼠的髓樣細(xì)胞數(shù)量和BALB/c小鼠相比具有增高趨勢(shì)。而兩種小鼠脾臟漿樣樹(shù)突細(xì)胞(CD11c+CD45R/B220+DCs)的數(shù)量在感染后3、5d，也呈逐漸增高趨勢(shì)，但BALB/c小鼠漿樣樹(shù)突的數(shù)量顯著高于DBA/2小鼠。
　　 2、細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1型細(xì)胞因子IL-12p40和IFN-γ以

24、及免疫效應(yīng)分子NO的分泌水平
　　 感染后第3d，DBA/2小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40的水平迅速升高，第5d盡管呈下降趨勢(shì)，但仍明顯高于正常水平。相比，BALB/c小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40的水平在感染后第3d和第5d均未見(jiàn)有意義的升高;BALB/c和DBA/2兩種小鼠于感染后第3～5d的IFN-γ水平均出現(xiàn)有意義的升高;但DBA/2小鼠IFN-γ產(chǎn)生水平顯著高于BALB/c小鼠。兩種小鼠NO水平于感染后第3

25、～5d也出現(xiàn)有意義升高，但DBA/2小鼠NO升高的水平明顯高于BALB/c小鼠。
　　 3、L-Arg處理后不同時(shí)間P.y17XL感染DBA/2和BALB/c小鼠脾臟DCs亞群的數(shù)量
　　 L-Arg處理組的BALB/c小鼠髓樣和漿樣DCs于感染后3、5d明顯升高，顯著高于Py17XL正常感染組，從兩種DCs亞群的活化程度來(lái)看，BALB/c正常感染組小鼠漿樣DCs略占優(yōu)勢(shì)，而L-Arg處理的BALB/c感染組小鼠髓樣DC

26、s活化程度明顯優(yōu)于漿樣DCs; L-Arg處理組的DBA/2小鼠髓樣和漿樣DCs于感染后3、5d明顯升高，并且以髓樣DCs活化為主。
　　 4、兩種小鼠經(jīng)L-Arg處理感染Py17XL后不同時(shí)間脾巨噬細(xì)胞的數(shù)量
　　 Py17XL感染DBA/2和BALB/c小鼠正常感染組和經(jīng)L-Arg處理組，巨噬細(xì)胞在感染后3、5d數(shù)量均高于未感染小鼠，但兩組小鼠之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但兩組小鼠活化的巨噬細(xì)胞數(shù)量存在明顯不同，在感染后3d，

27、L-Arg處理組小鼠巨噬細(xì)胞的活化數(shù)量明顯高于正常感染組。
　　 5、Py17XL感染BALB/c和DBA/2小鼠經(jīng)L-Arg處理后不同時(shí)間脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和NO的水平
　　 BALB/c和DBA/2小鼠經(jīng)L-Arg干預(yù)后，小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和NO水平明顯高于正常感染組，特別是有利于BALB/c小鼠IFN-γ和NO的產(chǎn)生，小鼠于感染后5d IFN-γ的水平仍高于正常感染組。
　　 6、通過(guò)R

28、eal Time RT-PCR檢測(cè)NO發(fā)生劑體內(nèi)處理Py17XL感染BALB/c小鼠，各侵襲相關(guān)分子基因的轉(zhuǎn)錄模式
　　 NO短效發(fā)生劑NOC5對(duì)重要的瘧原蟲(chóng)紅內(nèi)期侵襲蛋白AMA1，MSP1和RhopHcomplex具有一定的抑制作用，并且這種抑制作用在AMA1和MSP1兩個(gè)呈劑量依賴性;NO長(zhǎng)效發(fā)生劑NOC18顯示對(duì)AMA1，MSP1和RhopH complex這三個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平不如短效發(fā)生劑明顯，僅在高濃度時(shí)對(duì)MSP1的轉(zhuǎn)

29、錄水平起到上調(diào)作用而在低濃度時(shí)對(duì)RhopH complex轉(zhuǎn)錄起到抑制作用，但不如NOC5有規(guī)律可循。對(duì)Py235家族的轉(zhuǎn)錄水平的影響可見(jiàn)長(zhǎng)效NO發(fā)生劑NOC18對(duì)＃2104和＃5054具有抑制作用，而對(duì)＃3534在濃度高時(shí)具有抑制作用而在濃度低時(shí)具有上調(diào)作用;短效NO發(fā)生劑NOC5對(duì)Py235家族的影響顯示對(duì)＃2104和＃3534具有上調(diào)作用，高濃度時(shí)對(duì)＃4930具有上調(diào)作用，而對(duì)其他家族基因具有下調(diào)作用。
　　 7、通過(guò)Re

30、al Time PCR檢測(cè)NO短效發(fā)生劑NOC5不同濃度體外處理Py17XL純化裂殖體，各侵襲相關(guān)分子基因的轉(zhuǎn)錄模式
　　 NO短效發(fā)生劑NOC5體外處理Py17XL純化裂殖體可見(jiàn)對(duì)RhopH complex的轉(zhuǎn)錄水平未見(jiàn)影響，對(duì)AMA1和MSP1在濃度5mmol/L時(shí)具有一定上調(diào)作用，而在濃度10mmol/L時(shí)對(duì)MSP1水平具有一定下調(diào)作用;而對(duì)Py235家族基因的轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)在濃度1.25mmol/L時(shí)對(duì)＃2104，＃318

31、4，＃3432和＃4930具有一定下調(diào)作用，在濃度2.5mmol/L時(shí)對(duì)＃2104具有下調(diào)作用而對(duì)＃3184和＃4930具有一定的上調(diào)作用，在濃度5mmol/L時(shí)對(duì)＃649有上調(diào)作用而對(duì)＃2104具有下調(diào)作用，而在10mmol/L時(shí)對(duì)＃649，＃1365以及＃2104具有下調(diào)作用。
　　 8、通過(guò)Western Blot檢測(cè)NO發(fā)生劑體外處理致死型約氏瘧原蟲(chóng)裂殖體AMA1和RhopH complex蛋白的表達(dá)模式
　　

32、體外不同濃度短效NO發(fā)生劑NO5(1.25mmol/L，2.5mmol/L，5mmol/L和10mmol/L)處理純化的Py17XL裂殖體，利用Western Blot檢測(cè)AMA1和RhopHcomplex蛋白的表達(dá)顯示，NOC5對(duì)AMA1表達(dá)具有抑制作用，并且這種抑制作用具有劑量依賴性，而NOC510mmol/L時(shí)對(duì)RhopH complex蛋白具有抑制作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、P.yoelii17XL感染早期，

33、易感小鼠BALB/c和抵抗小鼠DBA/2在Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答存在明顯差異，這種Th1型免疫應(yīng)答可能是通過(guò)DCs分泌IL-12介導(dǎo)的。
　　 2、P.yoelii17XL感染早期，易感小鼠BALB/c和抵抗小鼠DBA/2在巨噬細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)量和NO產(chǎn)生水平存在明顯差異。
　　 3、L-Arg能顯著降低感染BALB/c和DBA/2小鼠的原蟲(chóng)血癥水平并延長(zhǎng)易感小鼠的生存率。
　　 4、L-Arg通過(guò)DCs活化來(lái)強(qiáng)化Th1

34、型應(yīng)答進(jìn)而遏制P.y17XL感染早期紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)的感染進(jìn)程。
　　 5、100ul，25mmol/L和100mmol/L NO5體內(nèi)注射Py17XL感染BALB/c小鼠30min可下調(diào)決定瘧原蟲(chóng)侵入的關(guān)鍵蛋白MSP1和AMA1的轉(zhuǎn)錄水平，并呈劑量依賴性。
　　 6、NO發(fā)生劑（長(zhǎng)期或短期）體內(nèi)干預(yù)P.y17XL感染BALB/c小鼠，瘧原蟲(chóng)在NO壓力下由弱毒力株向強(qiáng)毒力株轉(zhuǎn)變。
　　 7、體外不同濃度NOC5干預(yù)P