表達(dá)MAGE-A3的瘧原蟲減毒子孢子的構(gòu)建及誘導(dǎo)抗肺癌免疫的機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是當(dāng)前世界上的最常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡人數(shù)在我國位于所有腫瘤首位。盡管外科手術(shù)、化療、放療、分子靶向藥物治療等治療方式的不斷發(fā)展，但中晚期肺癌的療效并不理想，預(yù)后較差。近年來興起的免疫療法則主要通過增強機(jī)體的免疫應(yīng)答達(dá)到抗腫瘤作用，具有敏感性高、特異性強的特點，被認(rèn)為是最有希望的中晚期肺癌治療策略。
　　腫瘤疫苗不但能預(yù)防腫瘤的發(fā)生，而且還可以用于腫瘤的治療，是重要的腫瘤免疫治療策略之一。大量的研究證實，CD4/CD

2、8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答是機(jī)體的免疫系統(tǒng)監(jiān)視和抑制腫瘤的最主要效應(yīng)機(jī)制，因此是設(shè)計有效腫瘤疫苗的重要依據(jù)。然而目前并無較理想的腫瘤疫苗。究其原因，可能與機(jī)體的免疫耐受抑制腫瘤疫苗誘導(dǎo)強烈的CD4/CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答有關(guān)。因此，尋找能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體CD4/CD8+T應(yīng)答的腫瘤疫苗載體是目前研究的焦點。
　　鑒于瘧原蟲遺傳減毒子孢子(GAS)可以克服機(jī)體免疫耐受，并高效誘導(dǎo)瘧原蟲特異性CD8+/CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，本項目以遺傳減毒子孢子

3、作為載體，構(gòu)建表達(dá)主要肺癌相關(guān)抗原MAGE-A3的重組遺傳減毒子孢子疫苗，觀察能否活化MAGE-A3特異性CD4/CD8+T細(xì)胞，以達(dá)到抗肺癌的作用，并進(jìn)一步探討相關(guān)機(jī)制，這可為設(shè)計有效的肺癌等腫瘤疫苗提供新思路。
　　一、利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)MAGE-A3的瘧原蟲減毒子孢子
　　為了探討表達(dá)肺癌相關(guān)抗原MAGE-A3的重組遺傳減毒子孢子是否具有抗肺癌的作用，本研究擬利用CRIPSR-cas9技術(shù)對伯氏

4、瘧原蟲ANKA株(P.b ANKA)子孢子UIS3基因序列替換成肺癌相關(guān)抗原MAGE-A3，從而獲得能夠成功入侵肝細(xì)胞但不能在體內(nèi)繼續(xù)增殖發(fā)育，而且能夠表達(dá)MAGE-A3的重組遺傳減毒子孢子（GAS/MAGE-A3）。按照廈門大學(xué)袁晶教授的文章報道的實驗方法，設(shè)計并構(gòu)建用于編輯瘧原蟲基因組的CRIPSR-cas9重組質(zhì)粒（PYC質(zhì)粒）。然后通過電轉(zhuǎn)、藥物篩選等方式篩選出陽性單克隆重組子孢子。
　　1、利用CRISPR/Cas9技術(shù)

5、成功構(gòu)建了PYC/MAGE-A3重組質(zhì)粒
　　根據(jù)PYC質(zhì)粒以及P.b ANKA株UIS3基因序列特點，設(shè)計并合成sgRNA序列，隨后通過退火成功連接至PYC質(zhì)粒BsmBI位點上。然后從P.b ANKA株基因組中擴(kuò)增UIS3基因的5'UTR和3'UTR序列，從A549人肺腺癌細(xì)胞系中擴(kuò)增肺癌相關(guān)抗原MAGE-A3序列，隨后將三個片段通過重疊PCR、無縫克隆等方式插入到PYC質(zhì)粒的多克隆位點上。最后酶切及測序結(jié)果顯示所有片段均插入到

6、正確位置，并未發(fā)現(xiàn)堿基突變。
　　2、通過電轉(zhuǎn)、藥物篩選等方式成功獲得GAS/MAGE-A3重組減毒子孢子
　　將P.b ANKA株瘧原蟲和構(gòu)建的PYC質(zhì)?；旌想娹D(zhuǎn)后通過尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，24h后開始用8ug/mL乙胺嘧啶溶液進(jìn)行藥物篩選，持續(xù)給藥至原蟲血癥重新出現(xiàn)，開始進(jìn)行單克隆篩選，按照每只小鼠接種1條瘧原蟲稀釋接種，接種后第六天開始出現(xiàn)原蟲血癥，30只小鼠中共7只出現(xiàn)原蟲血癥，對出現(xiàn)原蟲血癥的單克隆小鼠提取的gDN

7、A進(jìn)行PCR以及測序鑒定，結(jié)果顯示其中1只為電轉(zhuǎn)成功的陽性單克隆瘧原蟲。
　　3.GAS/MAGE-A3重組減毒子孢子成功的轉(zhuǎn)錄并翻譯MAGE-A3重組蛋白
　　為了驗證轉(zhuǎn)基因瘧原蟲是否能夠轉(zhuǎn)錄并翻譯肺癌抗原MAGE-A3，我們提取了重組瘧原蟲子孢子RNA，然后將其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出MAGE-A3序列的950bp的條帶，說明GAS/MAGE-A3子孢子中的MAGE-A3基因成功轉(zhuǎn)錄。然后將分離純化的重組

8、瘧原蟲子孢子入侵HepG2細(xì)胞，24h后采用間接免疫熒光對HepG2細(xì)胞中MAGE-A3蛋白的表達(dá)進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因瘧原蟲子孢子納蟲空泡中出現(xiàn)MAGE-A3蛋白，而野生型瘧原蟲卻不表達(dá)MAGE-A3蛋白，說明GAS/MAGE-A3子孢子中的MAGE-A3基因成功表達(dá)。
　　二、表達(dá)MAGE-A3的瘧原蟲減毒子孢子抗肺癌免疫效果及機(jī)制研究
　　為了探討表達(dá)肺癌相關(guān)抗原MAGE-A3的重組遺傳減毒子孢子能否誘導(dǎo)

9、小鼠CD4+/CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，以達(dá)到抗肺癌作用。本實驗用PBS、GAS、GAS/MAGE-A3分別多次尾靜脈注射免疫HLA-A2小鼠，末次免疫后7天分別檢測各組小鼠外周血及脾臟CD4+/CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，然后采用Elispot檢測分泌IFN-γ的MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞。然后將分離收集的免疫小鼠脾臟的CD8+T細(xì)胞過繼到皮下接種A549的裸鼠體內(nèi)，觀察其抗肺癌效果。
　　1、GAS/MAGE-A3重組遺傳減毒子孢子

10、成功誘導(dǎo)小鼠CD4+/CD8+T細(xì)胞反應(yīng)
　　小鼠末次免疫后7天，F(xiàn)ACS分別檢測外周血及其脾臟的CD4+/CD8+T細(xì)胞頻率，結(jié)果顯示相較于PBS組，GAS/MAGE-A3組和GAS組都能明顯誘導(dǎo)外周血及其脾臟的CD4+/CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，且CD8+T細(xì)胞活化更加明顯。然后分離收集脾臟CD8+T細(xì)胞進(jìn)行Elispot檢測MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞，結(jié)果顯示GAS/MAGE-A3組明顯活化了MAGE-A3特異性CD8+T

11、細(xì)胞，而GAS組和PBS組均未發(fā)現(xiàn)。
　　2、GAS/MAGE-A3重組子孢子誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞具有顯著抗肺癌的作用
　　為了探討GAS/MAGE-A3重組遺傳減毒子孢子誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞是否具有抗肺癌的作用，在末次免疫后7天分離收集小鼠脾臟的CD8+T細(xì)胞，然后過繼到已經(jīng)皮下接種A549細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)，按照5×106/只，每1周一次，共注射三次，觀察是否具有抑制A549皮下瘤的增殖，達(dá)到抗肺癌的效果。
　　結(jié)果發(fā)

12、現(xiàn)，GAS/MAGE-A3組能夠有效抑制A549皮下瘤的增殖，并明顯延長小鼠的生存期，這說明MAGE-A3特異性的CD8+T細(xì)胞在抑制A549增殖起到主要作用。
　　3.GAS/MAGE-A3重組遺傳減毒子孢子通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡以及抑制血管生成誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)
　　腫瘤生長60天后，取出腫瘤并用多聚甲醛固定，石蠟包埋切片后，用Ki-67抗體、Tunel凋亡檢測試劑盒、CD31抗體，分別檢測腫瘤的增殖、凋亡及血管生

13、成情況。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAS/MAGE-A3重組遺傳減毒子孢子顯著抑制了腫瘤的增殖及血管生成，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　綜上所述，相比于傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9技術(shù)在瘧原蟲基因編輯上表現(xiàn)出高效、簡便等優(yōu)勢。GAS/MAGE-A3重組遺傳減毒子孢子不僅可以有效誘導(dǎo)CD4+/CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，還可以活化MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞。GAS/MAGE-A3誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞可以有效抑制A549細(xì)胞的增