樹突狀細(xì)胞在約氏瘧原蟲感染早期作用的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 瘧疾是由瘧原蟲感染引起的，最為嚴(yán)重的寄生原蟲感染性疾病。進(jìn)一步闡明誘導(dǎo)抗瘧保護(hù)性免疫應(yīng)答的相關(guān)機(jī)制，無疑將為瘧疾的有效控制提供必須的前提依據(jù)。
　　 約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17XL，P.yoelii17XL)感染的不同小鼠，會呈現(xiàn)不同的Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答模式，因而導(dǎo)致其出現(xiàn)自愈和死亡兩種截然相反的感染結(jié)局。
　　 表達(dá)不同模式識別受體(pattern recognition

2、 receptors，PRRs)Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)的樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)。在T細(xì)胞活化和適應(yīng)性免疫應(yīng)答建立過程中，發(fā)揮著舉足輕重的作用。
　　 我們利用成功建立的P.yoelii17XL感染的BALB/c和DBA/2鼠瘧模型，分析了參與抗瘧免疫應(yīng)答調(diào)控的相關(guān)因素。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動物及其模型構(gòu)建
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3、周齡、雌性BALB/c和DBA/2小鼠，經(jīng)腹腔分別感染1×106 P.yoelii17XL寄生的紅細(xì)胞(pRBC)，構(gòu)建不同的實(shí)驗(yàn)動物模型。
　　 2、采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測易感和抵抗小鼠感染早期脾臟DCs細(xì)胞內(nèi)TLR9和細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)水平
　　 (1)無菌取出感染前(0d)和感染后第3d、5d小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解紅細(xì)胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI

4、1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/ml。每份樣品用抗-CD11c-FITC單克隆抗體和抗-TLR9-PE單克隆抗體進(jìn)行雙色分析，另設(shè)陰性對照管。預(yù)先加入FcγIII/II封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1ml，再加入抗-CD11c-FITC單克隆抗體進(jìn)行表面染色。按試劑說明書所示，進(jìn)行固定和透膜后，再分別加入biotinylated anti-TLR9單克隆抗體和PE-conjugated streptavidin

5、。離心去上清后，洗滌兩次，靜置15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
　　 (2)每份樣品用抗-CD11c-FITC單克隆抗體和抗-TLR4-PE單克隆抗體進(jìn)行雙色分析，另設(shè)陰性對照管。在預(yù)先加入FcγIII/II封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1ml，再加入抗-CD11c-FITC單克隆抗體和抗-TLR4-PE單克隆抗體進(jìn)行表面染色。離心去上清后，洗滌兩次，靜置15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
　　 3

6、、采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測易感和抵抗小鼠感染早期脾臟DCs亞群的數(shù)量及細(xì)胞表面MHC II類分子和共刺激分子CD40、CD80的表達(dá)水平
　　 (1)每份樣品用抗-CD11c-FITC單克隆抗體、抗-CD11b-PE單克隆抗體和抗-CD45R/B220-PerCP單克隆抗體進(jìn)行三色分析，另設(shè)陰性對照管。預(yù)先加入FcγIII/II封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1 ml，再加入抗-CD11c-FITC單克隆抗體、

7、抗-CD11b-PE單克隆抗體和抗-CD45R/B220-PerCP單克隆抗體進(jìn)行表面染色。離心去上清后，洗滌兩次，靜置15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
　　 (2)每份樣品用抗-CD11c-FITC單克隆抗體和抗-MHC II-PE單克隆抗體或抗-CD40-PE單克隆抗體或抗-CD80-PE單克隆抗體進(jìn)行雙色分析，另設(shè)陰性對照管。在預(yù)先加入FcγIII/II封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1 ml，再加入抗

8、-CD11c-FITC單克隆抗體和抗-MHC II-PE單克隆抗體或抗-CD40-PE單克隆抗體或抗-CD80-PE單克隆抗體進(jìn)行表面染色。離心去上清后，洗滌兩次，靜置15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
　　 4、采用雙抗體夾心ELISA法檢測感染早期易感和抵抗小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40以及免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1的含量
　　 (1)脾DCs的純化及培養(yǎng)分別于感染前和感染后第3d和5d常規(guī)無菌

9、取出小鼠脾臟，用1 mg/ml膠原酶IV(Sigma Aldrich)37℃作用30 min，以0.17mol/L NH4Cl裂解紅細(xì)胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/ml。按照小鼠脾DCs純化試劑盒(BD Pharmingen San Diego，CA)說明書所示，從小鼠脾細(xì)胞懸液中陰性選擇純化脾DCs。生物素標(biāo)記的小鼠DCs純化雞尾酒抗體能夠識別除了DCs以外的所有白細(xì)胞表面表達(dá)的抗原并

10、與之結(jié)合。鏈酶親和素標(biāo)記的磁珠可以與生物素標(biāo)記的雞尾酒抗體特異性結(jié)合。因?yàn)檫@兩種試劑在純化DCs過程中，并不與DCs直接作用，因而可以避免DCs的異?；罨?。具體操作如下：20×106個脾細(xì)胞首先與2.4G2 mAb冰上共同孵育15 min，阻斷Fc受體。每1×106個脾細(xì)胞加入5μl生物素標(biāo)記的小鼠DCs純化雞尾酒抗體，冰上孵育15 min，洗滌、離心后，再加入5μl鏈酶親和素標(biāo)記的磁珠，6～12℃冷藏作用30 min。將標(biāo)記細(xì)胞轉(zhuǎn)移至

11、17×100mm圓底實(shí)驗(yàn)管中，并置于細(xì)胞分選器中作用8 min。仔細(xì)吸取上清(即為純化的DCs)，并置于無菌管中。用抗-CD11c-FITC單克隆抗體標(biāo)記純化的DCs，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測確定，CD11c+DCs純度可達(dá)到約70～85％。將脾DCs終濃度調(diào)整為1×106/ml，于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入500μl，培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清，-80℃保存，待IL-12p40、IL-10和TGF-β1檢測。
　　 (2)用雙抗體夾心

12、ELISA法對小鼠脾DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40、IL-10和TGF-β1的含量分別進(jìn)行檢測，酶標(biāo)儀檢測450nm處OD值。應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1LS軟件分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、易感和抵抗小鼠感染早期脾臟DCs細(xì)胞內(nèi)TLR9和細(xì)胞表面TLR4表達(dá)水平的比較
　　 BALB/c和DBA/2小鼠表達(dá)TLR9的CD11c+DCs的數(shù)量從感

13、染后第3d開始均明顯升高，并于感染后第5d達(dá)到最高水平，但在任一時間點(diǎn)，兩者比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。與感染前的對照組相比，BALB/c和DBA/2小鼠在感染后第3d和第5d表達(dá)TLR4的CD11c+DCs的數(shù)量均未見有意義的變化。
　　 2、易感和抵抗小鼠感染早期脾臟DCs亞群數(shù)量的比較
　　 BALB/c和DBA/2小鼠脾臟CD11c+CD11b+DCs的數(shù)量從感染后第3d開始均明顯升高，并于感染后第5d達(dá)到最高水平。在感

14、染后第3d，BALB/c小鼠脾臟CD11c+CD11b+DCs的數(shù)量明顯低于DBA/2小鼠。與此相反，兩種小鼠脾臟CD11c+CD45R/B220+DCs的數(shù)量在感染后3～5d，盡管也呈逐漸增高趨勢，但BALB/c小鼠CD11c+CD45R/B220+DCs的數(shù)量在感染后第3d和第5d均顯著高于DBA/2小鼠。
　　 3、易感和抵抗小鼠感染早期脾臟DCs細(xì)胞表面MHC II類分子和共刺激分子CD40、CD80表達(dá)水平的比較

15、>　　 BALB/c和DBA/2小鼠表達(dá)MHC II類分子和CD40分子的CD11c+DCs的數(shù)量從感染后第3d開始均明顯升高，并于感染后第5d達(dá)到最高水平。在感染后第3d和第5d，BALB/c小鼠表達(dá)MHC II類分子和CD40分子的CD11c+DCs的數(shù)量明顯低于DBA/2小鼠。與此同時，DBA/2小鼠表達(dá)CD80分子的CD11c+DCs的數(shù)量從感染后第3d開始迅速升高，并于感染后第5d達(dá)到峰值水平。而BALB/c小鼠表達(dá)CD80

16、分子的CD11c+DCs的數(shù)量僅在感染后第5d明顯升高，但其水平明顯低于DBA/2小鼠。
　　 4、易感和抵抗小鼠感染早期脾臟DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40以及免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1的含量比較
　　 感染后第3d，DBA/2小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40的水平迅速升高，感染后第5d盡管呈下降趨勢，但仍明顯高于正常水平。相比，BALB/c小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40的水平在感染后第3d和

17、第5d均未見有意義的升高，而且其水平均明顯低于DBA/2小鼠。
　　 兩種小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-10和TGF-β1水平在感染后第3～5d均明顯升高，但BALB/c小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-10和TGF-β1水平明顯高于DBA/2小鼠。
　　 結(jié)論：
　　 1、P.yoelii17XL感染早期，TLR9是介導(dǎo)小鼠DCs活化的重要模式識別受體。
　　 2、P.yoelii17XL感染早期，易感BALB/c

18、小鼠和抵抗DBA/2小鼠DCs亞群的分化模式存在顯著差異。
　　 3、P.yoelii17XL感染早期，易感BALB/c小鼠和抵抗DBA/2小鼠成熟表型的特征性分子MHC II類分子、CD40和CD80分子在表達(dá)水平和時相上均存在顯著差異。
　　 4、P.yoelii17XL感染早期，DCs可通過分泌IL-12啟動感染早期Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答的建立。
　　 5、P.yoelii17XL感染早期，DCs可通過分泌免疫