斯氏按蚊差異表達(dá)蛋白與約氏瘧原蟲卵囊黑化關(guān)系及信號調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、黑化包裹是按蚊抗瘧原蟲的一種特異的防御機(jī)制,可能是瘧原蟲表面分子與可溶性模式識別受體結(jié)合而觸發(fā),并激活絲氨酸蛋白酶(serine protease,SP)級聯(lián),最終導(dǎo)致前酚氧化酶(PPO)的分解激活酚氧化酶(PO),PO和其它蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)而黑化包裹瘧原蟲.但還不知道PPO是如何到中腸組織內(nèi)的,如何發(fā)生蛋白酶級聯(lián)的,以及如何參與雌按蚊內(nèi)瘧原蟲卵囊黑化過程的.瘧原蟲在按蚊中腸內(nèi)外經(jīng)歷了配子體、合子、動(dòng)合子和卵囊4個(gè)階段,卵囊成熟后,子孢子

2、逸出最后到達(dá)唾液腺而發(fā)育為感染期.斯氏按蚊是約氏瘧原蟲的易感媒介,卵囊很少黑化,該文利用斯氏按蚊吸飼硝喹乙酸鹽(Nitroquine acetate,NA)誘導(dǎo)產(chǎn)生約氏瘧原蟲卵囊黑化模型,在血細(xì)胞或中腸差異表達(dá)的黑化相關(guān)蛋白或基因分析基礎(chǔ)上初步探討誘導(dǎo)黑化及其信號調(diào)控機(jī)制.1.我們利用光鏡和透射電子顯微鏡觀察到用藥誘導(dǎo)后的約氏瘧原蟲卵囊黑化顆粒,中腸代謝和超微結(jié)構(gòu)異常改變,細(xì)胞間隙增寬.2.利用Bradford法測定不同食源條件下斯氏按

3、蚊雌蚊血淋巴和中腸蛋白濃度差異.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),NA組血淋巴蛋白濃度顯著下降,而IB和NA組間中腸蛋白濃度無顯著性差異.3.血淋巴SDS-PAGE顯示NA、IB、NB和S組均可見到數(shù)十條蛋白帶,分子量在160kDa和66kDa蛋白差異非常明顯,吸正常血及感染1d后66kDa蛋白表達(dá)增加,感染6~8d稍減弱,用藥1、2d稍增強(qiáng),3d開始下降.而160kDa蛋白在吸正常血及感染1d后呈上調(diào)表達(dá),以后減弱.4.對NA和IB組血淋巴和中腸蛋白進(jìn)

4、行2-DE和考馬斯亮藍(lán)染色,然后利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜的肽質(zhì)量指紋圖譜從15個(gè)血淋巴差異蛋白中初步鑒定出一種SP.利用抗岡比亞按蚊SP22D和PPO抗體進(jìn)行Western印跡發(fā)現(xiàn)在NA和IB組蚊存在SP22D和PPO蛋白,約氏瘧原蟲感染后斯氏按蚊血淋巴SP22D和PPO表達(dá)增強(qiáng),至6d達(dá)到峰值,在NA處理卵囊黑化過程中表達(dá)逐漸下降,但是黑化后斯氏按蚊中腸PPO含量呈現(xiàn)上升趨勢.2-DE和Western印跡提示雌斯氏按蚊成蚊

5、血淋巴內(nèi)存在PPO和SP22D基礎(chǔ)性表達(dá),PPO和SP22D在體時(shí)可能均是以二聚體形式存在.約氏瘧原蟲感染后,雌斯氏按蚊成蚊血淋巴內(nèi)PPO和SP22D水平是上升的,約氏瘧原蟲卵囊黑化后二者呈現(xiàn)下降表達(dá),而中腸內(nèi)PPO卻升高.2-DE及PMF發(fā)現(xiàn),用藥后中腸糖代謝、結(jié)構(gòu)和細(xì)胞信息聯(lián)系等蛋白表達(dá)水平下降.5.利用PPO和SP兼并引物和RT-PCR技術(shù),成功地從斯氏按蚊雌成蚊全蚊、血淋巴或中腸內(nèi)克隆到差異表達(dá)PPO1、SP1 和SP2基因,三

6、基因均呈現(xiàn)基礎(chǔ)性表達(dá),但是吸正常鼠血、約氏瘧原蟲感染血或用藥誘導(dǎo)卵囊黑化后表達(dá)水平上表現(xiàn)不同程度的差異,吸正常鼠血、感染血或用藥后SP1,PPO1和SP2表達(dá)均上調(diào),尤其感染及用藥后更明顯.ISH進(jìn)一步證實(shí)PPO1、SP1 和SP2均表達(dá)于血淋巴和中腸細(xì)胞內(nèi).6.在約氏瘧原蟲感染及黑化期間,轉(zhuǎn)錄因子Relish也隨斯氏按蚊食源的不同而發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄水平的變化.吸正常小鼠血24h Relish轉(zhuǎn)錄呈輕微上調(diào),吸感染血6h、12h、24h或4

7、8h的Relish表達(dá)均明顯增加,吸感染血5d和6d的Relish表達(dá)逐漸下降而趨近吸糖水水平,然而,吸NA糖水12h或24h的Relish表達(dá)呈中等水平增加.研究結(jié)果表明,PPO和SP兩種蛋白酶是約氏瘧原蟲卵囊黑化通路中重要的成分,可能同時(shí)在參與卵囊黑化包裹反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用.從時(shí)相點(diǎn)分析,Relish轉(zhuǎn)錄因子很可能參與PPO級聯(lián)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控.NA導(dǎo)致約氏瘧原蟲和/或斯氏按蚊中腸上皮細(xì)胞的化學(xué)損傷可能是黑化的始動(dòng)原因,可能抑制約氏瘧原