結(jié)腸腺瘤息肉蛋白N端功能區(qū)對(duì)細(xì)胞纖毛生長(zhǎng)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、纖毛(Cilia)是一種突出于細(xì)胞表面主要由細(xì)胞微管組成的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，還可作為細(xì)胞感受器，介導(dǎo)多種信號(hào)通路（Wnt、Hedgehog和PDGFR等），參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化等多種生命活動(dòng)。纖毛的結(jié)構(gòu)和功能異常導(dǎo)致纖毛相關(guān)疾病的發(fā)生。結(jié)腸腺瘤息肉蛋白(Adenomatous polyposis coli，APC)是一個(gè)腫瘤抑制因子。APC突變與家族性結(jié)腸腺瘤息肉病(Familial adenomatous polypo

2、sis，F(xiàn)AP)和Gardner綜合征的發(fā)生有關(guān)。Gardner綜合征是FAP的一個(gè)變體，它的腸外病變被報(bào)道是與纖毛異常相關(guān)的疾病，而APC突變是其發(fā)病的分子基礎(chǔ)。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于APC和纖毛之間的相關(guān)性及APC突變導(dǎo)致纖毛異常的機(jī)制尚不清楚。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：APC及其N端功能區(qū)對(duì)細(xì)胞纖毛生長(zhǎng)的影響。分別利用westernblotting和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)NIH3T3細(xì)胞中，APC在纖毛生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)變化及其

3、在纖毛的定位情況。將含有APC，APC-N，APC-M和APC-C的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入NIH3T3細(xì)胞中，觀察它們對(duì)纖毛生長(zhǎng)的影響;分別利用NIH3T3和MDCK細(xì)胞為模型，重點(diǎn)研究ACP N端的三個(gè)片段（APC-N1，ACP-N2和APC-N3）對(duì)細(xì)胞纖毛生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明APC在NIH3T3細(xì)胞纖毛的生長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)上調(diào)并且定位于纖毛的基體。APC的N端片段APC-N1，APC-N2和APC-N3（分別包含APC的氨基酸序列1-1018

4、，1019-2038和2039-2843）的表達(dá)不同程度的抑制纖毛組裝，其中APC-N2對(duì)纖毛形成的抑制影響最大，APC-N3和APC-N1次之。
　　第二部分：APC的N端功能區(qū)抑制纖毛生長(zhǎng)的機(jī)制研究。在上述實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)APC的N端片段抑制纖毛的形成，本實(shí)驗(yàn)從以下幾方面對(duì)它們抑制纖毛形成的機(jī)制進(jìn)行深入研究：⑴APC的N端功能區(qū)中的三個(gè)片段APC-N1，APC-N2和APC-N3過(guò)量表達(dá)對(duì)纖毛相關(guān)蛋白GSK-3β的影響；⑵APC

5、-N1，APC-N2和APC-N3在纖毛中的定位情況；⑶APC-N1，APC-N2和APC-N3過(guò)量表達(dá)對(duì)基體組成蛋白γ-tubulin和pericentrin的影響；⑷APC-N1，APC-N2和APC-N3過(guò)量表達(dá)對(duì)acetylated tubulin的影響;5，APC-N1，APC-N2和APC-N3過(guò)量表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①APC的N端片段通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而抑制GSK3β的活性，使得纖毛形成受

6、到抑制；②盡管APC的N端三個(gè)片段都抑制纖毛的形成，但是它們?cè)诶w毛基體中的定位是不同的:APC-N1定位于基體，而APC-N2和部分APC-N3不存在于基體；③APC-N2和APC-N3降低了細(xì)胞內(nèi)γ-tubulin的蛋白表達(dá)量，這可能導(dǎo)致纖毛受損；④過(guò)表達(dá)APC-N2降低細(xì)胞acetylated tubulin的表達(dá)，用抑制劑TSA處理后acetylated tubulin的表達(dá)量和纖毛生長(zhǎng)率都上升，表明APC-N2通過(guò)影響微管蛋白的

7、乙酰化抑制纖毛的形成；⑤APC的N端片段不是通過(guò)擾亂細(xì)胞周期進(jìn)展來(lái)抑制纖毛形成。
　　第三部分：APC的N端功能區(qū)對(duì)纖毛相關(guān)信號(hào)通路Wnt，Hedgehog和PDGFR的影響。本部分實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)western blotting檢測(cè)APC的N端三個(gè)片段的過(guò)量表達(dá)對(duì)纖毛相關(guān)信號(hào)通路Wnt，Hedgehog和PDGFR中重要組成成員蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明APC的N端三個(gè)片段過(guò)量表達(dá)后，Wnt信號(hào)通路中β-catenin的表達(dá)升高