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文檔簡介
1、Adenomatous Polyposis Coli,即結腸腺瘤息肉蛋白,簡稱APC,參與Wnt信號通路、細胞遷移、粘附、細胞極性、染色體正常分離等。纖毛是突出于細胞表面的一種亞細胞結構。纖毛形成受損或結構異常與多種疾病的發(fā)生相關。細胞粘附包括細胞間粘附和細胞基質間粘附,是惡性腫瘤始動轉移的關鍵。已有研究表明APC突變與纖毛形成受損和細胞粘附異常相關,但具體機制還不清楚。在多數(shù)APC突變的個體中都保留有其N端1至448個氨基酸的片段(命
2、名為APC-N1),這一片段包括一個寡聚結構域,導致APC同源二聚體結構的形成,從而使蛋白失去活性。本課題主要對 APC-N1片段影響纖毛形成和細胞粘附的機制進行研究,研究內容包括以下幾部分:
第一部分:首先利用熒光定量 PCR和 Western印跡方法檢測了 MDCK-GFP和MDCK-APC-N1穩(wěn)定細胞株的Hedgehog信號通路中兩個主要成員Ptch1和Gli1的表達情況。結果顯示,與對照MDCK-GFP細胞相比,MD
3、CK-APC-N1細胞中Ptch1和Gli1的表達上調,表明過表達APC-N1激活Hedgehog信號通路。分別利用RNA干擾技術和抑制劑GAN T61處理 MDCK-APC-N1細胞,發(fā)現(xiàn)當Gli1表達量降低時,細胞纖毛形成率顯著升高,表明過表達 APC-N1是通過 Hedgehog信號通路影響MDCK細胞纖毛形成。進一步利用 RNA干擾技術敲減 MDCK-APC-N1細胞中β-catenin,發(fā)現(xiàn)敲減β-catenin導致Gli1的
4、表達量降低。以上結果表明APC-N1通過β-catenin影響Hed ge ho g信號通路,進而抑制纖毛形成。
第二部分:利用熒光定量PCR檢測AurA的mRN A表達水平,發(fā)現(xiàn)AurA表達上調。分別通過RNA干擾技術和TSA藥物處理敲減AurA和抑制HDAC6表達,結果發(fā)現(xiàn)當AurA或HDAC6表達降低時,纖毛形成率明顯增加,表明過表達APC-N1是通過上調AurA/HDAC6表達而抑制纖毛形成。利用RNA干擾技術敲減Gl
5、i1檢測AurA和 HDAC6表達變化情況,結果發(fā)現(xiàn)Gli1表達降低時,AurA和 HDAC6表達量減少。這些結果表明,過表達APC-N1通過激活Hedgehog信號通路使AurA/HDAC6表達量上調,進而抑制纖毛形成。
第三部分:利用細胞間粘附實驗、熒光定量PCR、Western印跡檢測APC-N1對細胞間粘附和相關粘附分子E-cadherin的影響,結果發(fā)現(xiàn)APC-N1降低細胞-細胞間粘附和E-cadherin的表達。利
6、用結晶紫染色、熒光定量PCR、Western印跡檢測APC-N1對細胞基質間粘附和相關粘附分子 CD29的影響,結果發(fā)現(xiàn) APC-N1過表達提高細胞-基質間粘附能力和CD29的表達。利用RNA干擾技術敲減β-catenin導致E-cadherin表達上調卻對CD29沒有明顯影響,表明APC-N1通過β-catenin影響E-cadherin的表達。LY294002藥物處理MDCK-APC-N1細胞檢測E-cadherin和CD29的表達
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