NO對(duì)糖尿病小鼠近端結(jié)腸動(dòng)力的作用及機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病(diabetes mellitus，DM)結(jié)腸動(dòng)力障礙是DM極為常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，現(xiàn)有的研究主要集中與神經(jīng)、胃腸激素、血管病變以及高血糖有關(guān)，但其發(fā)病機(jī)制仍未明確。 一氧化氮(nitric oXide，NO)信號(hào)通路是腸神經(jīng)系統(tǒng)中比較重要的非腎上腺非膽堿能傳遞信號(hào)途徑。NO是胃腸道抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，已經(jīng)證實(shí)NO參與了DM的發(fā)生及其慢性并發(fā)癥的發(fā)展過(guò)程，并且發(fā)現(xiàn)在人和其它許多動(dòng)物的整個(gè)消化管及胃壁全層中都有一氧化氮合酶(

2、OXide synthase，NOS)分布。最新研究發(fā)現(xiàn)，DM大鼠結(jié)腸中神經(jīng)型NOS(neuronal NOS，nNOS)含量明顯增加。但到目前為止，沒(méi)有見(jiàn)到DM小鼠結(jié)腸中nNOS的含量與結(jié)腸動(dòng)力的相關(guān)性的研究報(bào)道。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Cajal問(wèn)質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是胃腸道的起搏細(xì)胞并在腸神經(jīng)信號(hào)傳遞中起著重要作用。有研究表明DM大鼠腸功能障礙時(shí)腸組織的ICC不規(guī)則分布、數(shù)量減少

3、且體積顯著縮小、導(dǎo)致異常的不規(guī)則慢波而使平滑肌收縮運(yùn)動(dòng)減慢，因此ICC的異常改變可能是DM腸功能障礙的病因之一。至今，未見(jiàn)到關(guān)于ICC與其內(nèi)nNOS在DM小鼠結(jié)腸動(dòng)力障礙中的作用的相關(guān)報(bào)道本研究選用小鼠近端結(jié)腸組織，設(shè)計(jì)了以下兩部分實(shí)驗(yàn)：(1)NO對(duì)19M小鼠近端結(jié)腸離體肌條收縮的影響，探討NO在DM小鼠結(jié)腸功能動(dòng)力障礙的作用。(2)以體外模擬DM的方式來(lái)探討ICC與NO在DM小鼠結(jié)腸動(dòng)力障礙發(fā)生的可能作用及兩者的相互關(guān)系。 第

4、一部分用免疫熒光染色觀察近端結(jié)腸中nNOS的分布；用免疫印跡法分析近端結(jié)腸中nNOS的含量；用離體結(jié)腸肌條實(shí)驗(yàn)觀察NO對(duì)DM小鼠近端結(jié)腸收縮的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，nNOS主要分布在結(jié)腸肌層(包括肌間層、深肌層)和粘膜下層。與正常組比較，DM組的nNOS的含量明顯升高。DM小鼠近端結(jié)腸肌張力較正常小鼠降低，加入nNOS的抑制劑 7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)后，正常組和DM病組小鼠肌張力均顯著增加，但DM組肌張力比正

5、常組增加明顯(P<0.05)；而加入iNOS的抑制劑氨基胍(Amino guanidine，AG)前后結(jié)腸張力均無(wú)明顯變化(P>0.05)；NO前體L-精氨酸(l-arginine，L-Arg)對(duì)小鼠近端肌條的肌張力有明顯的抑制作用(P<0.05)，DM組抑制作用較正常組明顯。加藥前后對(duì)結(jié)腸收縮頻率無(wú)影響。 第二部分探討ICC在高糖培養(yǎng)下其細(xì)胞形態(tài)、活力以及其內(nèi)nNOS的表達(dá)的改變。主要是以小鼠近端結(jié)腸為ICC的組織來(lái)源，應(yīng)用酶

6、解法分離、培養(yǎng)ICC，按細(xì)胞培養(yǎng)基成分的不同分為三組：第一組，正常對(duì)照組(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)；第二組，甘露醇滲透壓對(duì)照組(葡萄糖濃度為5.5mmol/L、甘露醇濃度為275mmol/L)，作用是高滲對(duì)照；第三組，高糖組(葡萄糖濃度為33mmol/L)；觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活力的改變；利用Western-Blot對(duì)ICC內(nèi)的神經(jīng)型NOS(nNOS)的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，高糖處理使ICC細(xì)胞變圓，突起變短，與周圍的鄰近細(xì)胞網(wǎng)

7、絡(luò)不明顯、細(xì)胞活力也下降(P<005)，同時(shí)nNOS含量明顯降低。而高滲對(duì)照組則對(duì)ICC形態(tài)、活力和nNOS表達(dá)無(wú)顯著影響。通過(guò)以上研究，我們得出以下結(jié)論： 1．DM小鼠近端結(jié)腸中nNOS表達(dá)增加，引起了近端結(jié)腸收縮張力下降、收縮頻率不改變，提示nNOS在DM小鼠結(jié)腸動(dòng)力障礙中有重要作用。 2．建立了ICC的培養(yǎng)方法，利用高糖培養(yǎng)下的ICC這個(gè)體外模擬DM的模型，證實(shí)了ICC內(nèi)的nNOS表達(dá)下降，而nNOS表達(dá)下降可能與