Megsin對(duì)糖尿病小鼠腎組織ERK及ECM作用的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(Diabetic nephropathy， DN)是糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥之一，它的危害巨大，不積極治療，最終可發(fā)展成終末期腎衰竭。糖尿病腎病在美國(guó)和歐洲已成為引起終末期腎病的最常見病因，約占終末期腎病接受透析的40％。2001年，對(duì)我國(guó)30個(gè)省市自治區(qū)住院患者的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，DN患病率約為33％，因此探索DN的發(fā)病機(jī)制及防治策略成為目前廣大腎臟病學(xué)者關(guān)注的課題。
　　 研究認(rèn)為，糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制與糖脂代謝紊亂、多元

2、醇通路激活、蛋白激酶C激活、高血壓所致的腎血流動(dòng)力學(xué)改變、氧化應(yīng)激、血管活性物質(zhì)及細(xì)胞因子、遺傳因素等多因素有關(guān)。DN的病變特征是腎小球肥大，其病理學(xué)基礎(chǔ)是腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cell， GMC)增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix， ECM)積聚，從而導(dǎo)致腎小球高濾過和蛋白尿，最后導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。ECM的積聚是由于ECM合成增加和降解減少所致，多種原因，比如細(xì)胞

3、因子或生長(zhǎng)因子等促進(jìn)了系膜增殖、系膜細(xì)胞肥大和基質(zhì)分泌增加。同時(shí)還存在著ECM降解減少，目前已知道參與ECM降解的酶主要有三類：絲氨酸蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）及半胱氨酸蛋白酶。基質(zhì)金屬蛋白酶可以降解ECM中的Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ型膠原。纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor, PAI-1)能夠抑制絲氨酸蛋白酶，使ECM降解減少。它

4、們的動(dòng)態(tài)失衡直接參與了ECM的積聚。
　　 Megsin(mesangial cell-predominant gene with a homology to serpin)是一種系膜細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因，屬serpin超家族成員，其能夠與絲氨酸蛋白酶結(jié)合，發(fā)揮絲氨酸蛋白酶抑制劑活性。已有研究發(fā)現(xiàn)，在IgA腎病的系膜細(xì)胞中，其基因與蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。提示megsin作為serpin的成員，必定參與了GMC的某些病理生理過程。糖尿

5、病腎病作為一種以系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)積聚為主要病理改變的疾病，megsin基因怎樣參與糖尿病腎病的發(fā)病過程及其作用途徑如何目前尚未闡明。因此探討megsin在GMC細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解中的作用對(duì)于深入揭示糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。
　　 本課題建立糖尿病CD-1小鼠模型并轉(zhuǎn)染Megsin基因，同時(shí)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使megsin在小鼠腎臟組織中過表達(dá)或表達(dá)抑制，從整體、細(xì)胞和分子水平觀察megsin、血小板衍生生長(zhǎng)因子

6、-BB(platelet-derived growth factor-BB， PDGF-BB)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase， ERK1/2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growthfactor-β1， TGF-βi)、Ⅳ型膠原(collagenⅣ)等表達(dá)的變化，從而探討megsin在糖尿病腎病發(fā)病過程中可能的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路及

7、其對(duì)ECM合成的影響；通過細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（Extracellular matrix metalloproteinases inducer， EMMPRIN）、MMP-9及Ⅳ膠原表達(dá)的變化，探討megsin對(duì)高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞ECM降解的影響；通過藥物干預(yù)，觀察吡格列酮(pioglitazone)對(duì)高糖環(huán)境中megsin、MMP-2、PAI-1及Ⅳ型膠原表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討megsin在糖尿病腎損害中發(fā)病中的作用及其防治

8、提供新的途徑。
　　 方法：
　　 第一部分：選取清潔級(jí)健康雄性CD-1小鼠60只，行單側(cè)腎切除，2周后切口完全愈合。隨機(jī)抽取45只腹腔注射鏈尿佐菌素(streptozotocin，STZ)150mg/kg制備糖尿病小鼠模型。將檢測(cè)成模的45只小鼠隨機(jī)分為三組，構(gòu)建megsin表達(dá)質(zhì)粒并經(jīng)尾靜脈注射轉(zhuǎn)染小鼠(D組，n=15)每周一次、單純糖尿病組(B組，n=15)、糖尿病+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(C組，n=15)，將只做單側(cè)腎切除

9、的小鼠作為正常對(duì)照組（A組，n=15）。實(shí)驗(yàn)共12周，在2、4、12周末收集小鼠血液、尿液及腎組織標(biāo)本，檢測(cè)其血糖(BG)、血清肌酐(Scr)、小鼠腎重與體重比值(KW/BW)、尿蛋白(UP)。在2、4、12周末收集腎組織標(biāo)本，分別應(yīng)用免疫組化染色和蛋白印記法測(cè)定腎組織中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及Ⅳ型膠原的表達(dá)。建立穩(wěn)定表達(dá)megsin小鼠系膜細(xì)胞株，高糖環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)(D組)，同時(shí)設(shè)立小鼠系膜細(xì)胞

10、低糖培養(yǎng)組(A組，5.5mmol/L D-葡萄糖)、高糖培養(yǎng)組（B組，30mmol/L D-葡萄糖）、高糖+轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒培養(yǎng)組（C組）和轉(zhuǎn)染megsin質(zhì)粒+高糖+U0126組（E組），分別于12、24、48小時(shí)末收集各組細(xì)胞及上清，提取蛋白，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色測(cè)定細(xì)胞中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及FN的表達(dá)，應(yīng)用蛋白印記法測(cè)定各組總蛋白中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表達(dá)，

11、放免法測(cè)定細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原的濃度。
　　 第二部分：動(dòng)物模型制備同第二部分，經(jīng)尾靜脈注射megsin siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CD-1糖尿病小鼠(D組)，每周注射1次，并設(shè)立糖尿病組(B組)、糖尿病+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（C組），單側(cè)腎切除對(duì)照組(A組)，每組各15只小鼠，實(shí)驗(yàn)共12周，在2、4、12周末收集小鼠血液、尿液及腎組織標(biāo)本，檢測(cè)其BG、Scr)、小鼠腎重與體重比值(KW/BW)及UP。在2、4、12周末收集腎組織標(biāo)本，分別應(yīng)用

12、免疫組化染色和蛋白印記法測(cè)定腎組織中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及Ⅳ型膠原的表達(dá)。體外培養(yǎng)小鼠系膜細(xì)胞，應(yīng)用脂質(zhì)體作為載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染megsin siRNA質(zhì)粒，在高糖環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)（D組，），并設(shè)立小鼠系膜細(xì)胞低糖培養(yǎng)組(A組，5.5mmol/L D-葡萄糖)、高糖培養(yǎng)組(B組，30mmol/L D-葡萄糖)、高糖+空質(zhì)粒培養(yǎng)組（C組），于12、24、48小時(shí)末收集每組細(xì)胞和上清，提取蛋白，應(yīng)用免疫細(xì)胞

13、化學(xué)染色測(cè)定細(xì)胞中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及纖維連接蛋白的表達(dá)，應(yīng)用蛋白印記法測(cè)定各組總蛋白中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表達(dá)，放免法測(cè)定細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原的濃度。
　　 第三部分：建立穩(wěn)定表達(dá)megsin的小鼠系膜細(xì)胞，在高糖環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)(D組)；應(yīng)用脂質(zhì)體2000作為載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染megsin siRNA質(zhì)粒，在高糖環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)，(E組)，并設(shè)立小

14、鼠系膜細(xì)胞低糖培養(yǎng)組(A組，5.5mmol/L D-葡萄糖)、高糖培養(yǎng)組（B組，30mmol/L D-葡萄糖）、高糖+空質(zhì)粒培養(yǎng)組（C組），分別于12、24、48小時(shí)末收集各組細(xì)胞及上清，提取蛋白，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色測(cè)定細(xì)胞中megsin、EMMPRIN及MMP-9的表達(dá)，應(yīng)用蛋白印記法測(cè)定各組megsin、EMMPRIN和MMP-9蛋白的表達(dá)，放免法測(cè)定細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原的濃度。
　　 第四部分：取小鼠系膜細(xì)胞種植于96孔

15、板，采用MTT法分別檢測(cè)低糖、高糖及干預(yù)藥物吡格列酮對(duì)系膜細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。采用6孔板和25cm2塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞分成3組：低糖組(A組，5.5mmol/L D-葡萄糖)、高糖組(B組，30mmol/L D-葡萄糖)、高糖+吡格列酮組(C組)，于48小時(shí)末收集各組細(xì)胞及上清，提取蛋白，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色測(cè)定細(xì)胞中megsin、EMMPRIN、MMP-2、PAI-1的表達(dá)，應(yīng)用蛋白印記法測(cè)定各組總蛋白中megsin、EMMP

16、RIN、MMP-2、PAI-1的表達(dá)，放免法測(cè)定細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原的濃度（結(jié)果用總蛋白校正）。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：
　　 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：與A組相比，B組、C組小鼠在第4周時(shí)可見KW/BW、Scr、UP升高(P＜0.01)，D組升高更為明顯(P＜0.01);12周時(shí)，上述改變更加顯著。從第2周開始，光鏡下觀察B組、C組小鼠可見腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)增多，腎小球體積稍增大，系膜區(qū)基質(zhì)增多；PAS染色可見陽(yáng)性紅染

17、物質(zhì)增加，Masson染色可見膠原纖維增多；D組變化較B組、C組明顯；到12周末時(shí)上述變化更為顯著。免疫組化及蛋白印記結(jié)果顯示，與A組先比，第2周末即可見B組、C組、D組CD-1小鼠腎組織中megsin表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)，D組與B、C組相比，表達(dá)更加明顯(P＜0.01)。B組、C組、D組隨著時(shí)間延長(zhǎng)，megsin在腎組織的表達(dá)逐漸加強(qiáng)，至12周末表達(dá)最強(qiáng)，各時(shí)間點(diǎn)之間相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.01）。B組、C組、D組PDGF

18、-BB、pERK1/2、TGF-β1、FN及Ⅳ型膠原在第2周末表達(dá)增強(qiáng)，與A組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.01)，D組與B、C組相比，表達(dá)更加顯著（P均＜0.01）。B組、C組、D組隨著時(shí)間延長(zhǎng)，上述指標(biāo)在腎組織的表達(dá)逐漸加強(qiáng)，至12周末表達(dá)最強(qiáng)。蛋白印記檢測(cè)megsin、PDGF-BB、pERK1/2及TGF-β1蛋白在各組、各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)的結(jié)果與免疫組化相一致。
　　 2.體外系膜細(xì)胞培養(yǎng)：免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，高糖培養(yǎng)組（

19、B組）及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組（C組）從12h開始，megsin、PDGF-BB表達(dá)即開始增強(qiáng)，且隨時(shí)間表達(dá)有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，至48小時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，與A組同時(shí)相相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)，兩組各時(shí)間點(diǎn)之間相比，megsin及PDGF-BB表達(dá)也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。而經(jīng)轉(zhuǎn)染megsin質(zhì)粒(D組)后，megsin及PDGF-BB表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)顯著增強(qiáng)，與B組各時(shí)相相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。經(jīng)過U

20、0126干預(yù)(E組)后發(fā)現(xiàn)，在各時(shí)間點(diǎn)與D組相比，megsin、PDGF-BB表達(dá)沒有顯著降低(P均＞0.05)。高糖培養(yǎng)組(B組)及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(C組)從12h開始，pERK1/2、TGF-β1及FN表達(dá)即開始增強(qiáng)，且隨時(shí)間表達(dá)有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，至48小時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，與A組同時(shí)相相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)，兩組組各時(shí)間點(diǎn)之間相比，三者表達(dá)也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。而經(jīng)轉(zhuǎn)染megsin質(zhì)粒（D組）后，pERK1/

21、2、TGF-β1及FN表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)顯著增強(qiáng)，與B組各時(shí)相相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。經(jīng)過U0126干預(yù)(E組)后發(fā)現(xiàn)，在各時(shí)間點(diǎn)與D組相比，三者表達(dá)顯著降低(P均＜0.01)。蛋白印記法檢測(cè)megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1蛋白在各組、各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)與免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果相一致。細(xì)胞上清液Ⅳ型膠原測(cè)定結(jié)果顯示B組和C組上清液中Ⅳ型膠原含量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，48h達(dá)高峰，與A組同時(shí)相相比，

22、其含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.01)；D組與B組同時(shí)相相比，上清液中Ⅳ型膠原的含量則隨時(shí)間延長(zhǎng)增加顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）；與D組同時(shí)相相比，E組其含量則顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.01）。
　　 第二部分：
　　 1．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：B組、C組、D組小鼠注射ST24～5天后即出現(xiàn)多飲、多食、多尿表現(xiàn)，而A組則無上述表現(xiàn)。B組、C組小鼠KW/BW、血清肌酐和UP在第2周開始升高，D組較A組略有下降，

23、但與A組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與A組相比，B組小鼠從第4周開始，KW/BW、血清肌酐、UP升高(P＜0.01)，C組升高更為明顯(P＜0.01)；D組與B組相比KW/BW、血清肌酐、UP下降(P＜0.01)，12周時(shí)，上述改變更加顯著。從第二周開始，光鏡下觀察B組、C組小鼠腎小球體積稍增大，基底膜普遍增厚，系膜區(qū)基質(zhì)增多，D組變化較B組減輕；到12周末時(shí)上述變化更為顯著。免疫組化和蛋白印記結(jié)果顯示，與A組相比，B組從第二周開始，其腎小球

24、megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及Ⅳ型膠原表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)；D組轉(zhuǎn)染megsin siRNA后，與B組相比腎小球megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及Ⅳ型膠原表達(dá)減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，與A組相比，B組腎小球megsin、pERK1/2、PDGF-BB、TGF-β1及Ⅳ型膠原表達(dá)進(jìn)一步加強(qiáng)(P＜0.01)，12周是表達(dá)最強(qiáng)，D組上述各項(xiàng)指標(biāo)較B組減

25、弱(P＜0.01)。B組和C組上述指標(biāo)在各時(shí)間點(diǎn)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2．細(xì)胞培養(yǎng)：免疫細(xì)胞化學(xué)及蛋白印記結(jié)果顯示，從12小時(shí)開始，B組較A組小鼠系膜細(xì)胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及FN表達(dá)及蛋白水平開始升高(P＜0.01)，48小時(shí)達(dá)高峰，C組與B組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；D組與B組同期相比，megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及FN表

26、達(dá)及蛋白水平減弱，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)；從12小時(shí)開始，與A組相比，B組小鼠系膜細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（細(xì)胞總蛋白校正）開始升高，48小時(shí)達(dá)高峰(＜0.01)，C組與B組同期相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)，但D組與B組同期相比，系膜細(xì)胞上清液中Ⅳ膠原濃度顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 第三部分：免疫細(xì)胞化學(xué)及蛋白印記結(jié)果顯示，與A組相比，從12小時(shí)開始，B組小鼠系膜細(xì)胞megsin表達(dá)及蛋白

27、水平開始升高(P＜0.01)，48小時(shí)達(dá)高峰，C組與B組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；D組與B組同期相比，megsin表達(dá)及蛋白水平升高更加明顯(P＜0.01)；E組與B組、D組同期相比，megsin表達(dá)及蛋白水平均顯著減弱(P＜0.01)；從12小時(shí)開始，B組較A組EMMPRIN、MMP-9表達(dá)及蛋白水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，48小時(shí)達(dá)高峰，C組與B組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；D組與B組同期相比

28、，EMMPRIN、MMP-9表達(dá)及蛋白水平下降更加明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)；E組與B組、D組同時(shí)相相比，EMMPRIN及MMP-9表達(dá)明顯增強(qiáng)及蛋白水顯著升高(P＜0.01)；從12小時(shí)開始，與A組相比，B組小鼠MC上清液中Ⅳ型膠原濃度（細(xì)胞總蛋白校正）開始升高，48小時(shí)達(dá)高峰(＜0.01)，D組與B組相比，MC上清液中Ⅳ膠原濃度升高更明顯(P＜0.01)，E組與B組、D組同期相比，系膜細(xì)胞上清液中Ⅳ膠原濃度則有顯著性下降，

29、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 第四部分：免疫細(xì)胞化學(xué)及蛋白印記結(jié)果顯示，與A組相比，48h時(shí)B組小鼠系膜細(xì)胞megsin、PAI-1表達(dá)及蛋白水平升高(P＜0.01)，C組與B組同期相比，megsin及PAI-1表達(dá)減弱及蛋白水平降低(P＜0.01);B組較A組EMMPRIN、MMP-2表達(dá)減弱及蛋白水平下降(P＜0.01)，C組與B組同期相比，EMMPRIN、MMP-9表達(dá)增強(qiáng)及蛋白水平升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜

30、0.01)；與A組相比，B組小鼠系膜細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（細(xì)胞總蛋白校正）升高(＜0.01)，C組與B組同期相比，系膜細(xì)胞上清液中Ⅳ膠原濃度明顯下降(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，糖尿病狀態(tài)下megsin基因在腎小球表達(dá)增強(qiáng)，與腎小球系膜增殖及ECM積聚相一致，提示megsin在糖尿病小鼠腎損害的發(fā)病機(jī)制中具有一定的作用。
　　 2.過表達(dá)的megsin可促進(jìn)糖尿病小鼠

31、腎組織或系膜細(xì)胞ECM積聚，其作用機(jī)制一方面可能是通過PDGF-BB誘導(dǎo)的ERK通路激活，TGF-β1表達(dá)增加，使FN的表達(dá)及Ⅳ型膠原的含量增加而實(shí)現(xiàn)的；另一方面過表達(dá)的megsin可抑制糖尿病小鼠腎組織或系膜細(xì)胞EMMPRIN、MMP-9的表達(dá)，導(dǎo)致了ECM的降解減少，從而參與了糖尿病小鼠腎損害的發(fā)病過程。
　　 3.megsin siRNA和吡格列酮可下調(diào)糖尿病小鼠腎組織或系膜細(xì)胞megsin基因的表達(dá)，通過抑制ERK通路轉(zhuǎn)