電針刺激對(duì)糖尿病大鼠結(jié)腸動(dòng)力的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分便秘型糖尿病大鼠結(jié)腸動(dòng)力及ICC的改變
　　目的:以便秘型糖尿病大鼠為動(dòng)物模型,研究糖尿病狀態(tài)下結(jié)腸動(dòng)力和ICC的改變。
　　方法:20只體重約250-300g的雄性SD(Sprague Dawley)大鼠,購(gòu)置于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件為18-22℃,自由飲食水、自由活動(dòng)。待其適應(yīng)環(huán)境后(通常為一周左右),對(duì)其進(jìn)行造模,具體方法如下:60mg/kg鏈脲佐菌素腹腔注射用來(lái)制作糖尿病模型(n=10),于

2、造模8周后處死;相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組大鼠(n=10)腹腔注射同等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(PH=7.4),分別與同期糖尿病大鼠一起處死。同時(shí)取出各組大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織,然后分別按照免疫組化、實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time polymerase chain reactions,RT-PCR)、Western Blot方法的要求保存標(biāo)本。分別于造模前、造模后1周、4周和8周記錄兩組大鼠的血糖和體重;結(jié)腸傳輸時(shí)間來(lái)評(píng)估兩組大鼠結(jié)腸動(dòng)力的情況;

3、免疫組化、RT-PCR和Western blot用來(lái)評(píng)估結(jié)腸c-kit的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)基礎(chǔ)狀態(tài)下兩組大鼠血糖沒有明顯差異;造模后第1周、4周和8周,糖尿病大鼠血糖相對(duì)于正常組顯著性升高(32.0±1.7mmol L-1vs6.2±1.1mmol L-1,P=0.000;33.1±0.4mmol L-1vs6.5±1.2mmol L-1,P=0.000;32.9±0.7mmol L-1vs5.7±0.9mmol L-1

4、,P=0.000);(2)基礎(chǔ)狀態(tài)下兩組大鼠體重沒有明顯差異;造模后4周和8周,糖尿病大鼠體重相對(duì)于正常組而言顯著下降(293.3±10.8gvs377.8±9.0g,P=0.000;266.5±19.4gvs481.5±42.2g,P=0.000);(3)基礎(chǔ)狀態(tài)下兩組大鼠結(jié)腸傳輸時(shí)間沒有明顯差異;造模后4周和8周,便秘型糖尿病大鼠結(jié)腸傳輸時(shí)間相對(duì)于正常組而言顯著延長(zhǎng)(122.0±6.4minvs16.1±3.2min,P=0.000

5、;265.7±23.9minvs15.1±4.5min,P=0.000)。(4)RT-PCR研究提示糖尿病組大鼠結(jié)腸c-kit mRNA的表達(dá)量相對(duì)于正常組明顯降低(0.4±0.1vs5.7±1.4,P=0.000)。(5)相對(duì)于正常組而言,糖尿病組大鼠結(jié)腸c-kit陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯減少;Western blot研究提示糖尿病大鼠結(jié)腸c-kit蛋白表達(dá)量顯著下降(0.144±0.035vs0.915±0.071,P=0.000)。

6、>　　結(jié)論:便秘型糖尿病大鼠結(jié)腸傳輸減慢,并且伴隨ICC的缺失。
　　第二部分 SCF/Kit信號(hào)通路在糖尿病大鼠結(jié)腸動(dòng)力及ICC改變中的作用
　　目的:以便秘型糖尿病大鼠為動(dòng)物模型,研究糖尿病狀態(tài)下結(jié)腸SCF/Kit信號(hào)通路在結(jié)腸動(dòng)力和ICC改變中的作用。
　　方法:20只雄性SD大鼠,體重約250-300g,購(gòu)置于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件為18-22℃,自由飲食水、自由活動(dòng)。一周后待其適應(yīng)環(huán)境,對(duì)其

7、進(jìn)行造模,方法如下:鏈脲佐菌素60mg/kg腹腔注射用來(lái)制作糖尿病模型(n=10),于造模后8周處死;相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組(n=10)腹腔注射同等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(PH=7.4),分別與同期糖尿病大鼠一起處死。采取各組大鼠腹主動(dòng)脈血3ml,并且同時(shí)取出各組大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織,然后分別按照Real-time PCR、Western Blot以及Elisa方法的要求保存標(biāo)本。實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)和W

8、estern Blot法來(lái)檢測(cè)結(jié)腸中膜結(jié)合型SCF(membrane-bound stem cell factor,M-SCF)表達(dá)量的變化;Elisa法檢測(cè)各組大鼠血清中游離型SCF(soluble stem cell factor,S-SCF)的濃度改變。
　　結(jié)果:(1)糖尿病大鼠M-SCF mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著下降(0.6±0.2 vs2.9±0.5,P=0.000);(2)相對(duì)于正常組而言,糖尿病組大鼠結(jié)腸M-SC

9、F蛋白的表達(dá)量也顯著性下降(0.194±0.016vs0.971±0.055,P=0.000);(3)與正常組相比,糖尿病組大鼠血清S-SCF水平顯著下降(13.3±4.9pg ml-1 vs22.4±2.9pg ml-1,P=0.000)。
　　結(jié)論:便秘型糖尿病大鼠結(jié)腸膜結(jié)合型SCF的表達(dá)量和血清游離型SCF表達(dá)量均下降,并且其變化與c-kit表達(dá)量呈正相關(guān)。
　　第三部分電針刺激對(duì)便秘型糖尿病大鼠結(jié)腸動(dòng)力及ICC和SC

10、F/Kit信號(hào)通路的影響
　　目的:ICC的缺失與糖尿病胃腸動(dòng)力紊亂相關(guān),電針刺激可以有效的緩解胃腸道動(dòng)力紊亂。但是,電針刺激糖尿病大鼠胃腸道癥狀緩解的機(jī)制仍然不明。本研究的目的是以便秘型糖尿病大鼠為動(dòng)物模型,評(píng)估電針刺激對(duì)便秘型糖尿病大鼠結(jié)腸傳輸和ICC的影響,以及SCF/c-kit信號(hào)通路在電針調(diào)節(jié)腸道動(dòng)力和ICC中所起的作用。
　　方法:體重約250-300g的雄性SD大鼠50只隨機(jī)分為五組:正常對(duì)照組(n=10)、糖

11、尿病模型組(n=10)、假性刺激組(n=10)、低頻刺激組(n=10)、高頻刺激組(n=10)。電針每日刺激足三里30min,持續(xù)8周。分別于造模前1周、造模后1周、造模后4周和造模后8周評(píng)估各組大鼠血糖、體重以及結(jié)腸傳輸?shù)淖兓?體外平滑肌條用來(lái)評(píng)估ICC移除前后結(jié)腸平滑肌條收縮性的變化;免疫組化、RT-PCR和Western blot用來(lái)評(píng)估結(jié)腸c-kit的表達(dá);RT-PCR和Western blot用來(lái)評(píng)估結(jié)腸M-SCF的表達(dá);El

12、isa法用來(lái)評(píng)估各組大鼠血清S-SCF的變化。
　　結(jié)果:(1)基礎(chǔ)狀態(tài)下各組大鼠血糖和體重沒有顯著性差異,4&8周時(shí),高頻刺激組大鼠體重相對(duì)于糖尿病組有所增加,而血糖無(wú)顯著性變化;(2)基礎(chǔ)狀態(tài)下各組大鼠結(jié)腸傳輸無(wú)顯著性變化,4&8周時(shí),糖尿病組大鼠結(jié)腸傳輸時(shí)間相對(duì)于正常組而言顯著延長(zhǎng)(122.0±6.4min vs.16.1±3.2min,P=0.000;265.7±23.9min vs.15.1±4.5min,P=0.000

13、),高頻刺激組可以提高結(jié)腸傳輸時(shí)間(36.7±6.6min vs.122.0±6.4min,P=0.000;43.1±4.2min vs.265.7±23.9min,P=0.000);(3)相對(duì)于糖尿病組,低頻和高頻刺激組均可以增加結(jié)腸肌條收縮性的前后降低率;(4)相對(duì)于糖尿病組,低頻和高頻刺激均可以增加結(jié)腸c-kit mRNA和蛋白的表達(dá)量;(5)低頻和高頻電針刺激相對(duì)于糖尿病組而言均可以增加結(jié)腸M-SCF mRNA和蛋白的表達(dá)量;(