電針刺激糖尿病小鼠足三里穴(ST-36)保護胃組織ICC的機制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分:
　　第一部分:糖尿病小鼠電針模型的構建及胃組織ICC的改變
　　目的:以糖尿病小鼠動物模型為基礎進一步構建電針模型，研究電針刺激作用下糖尿病小鼠胃組織中ICC的變化。
　　方法:6-8周齡雄性C57BL/6小鼠50只，隨機分為5個組：正常組（Control）、糖尿病組（DM）、糖尿病假性電針刺激組（DM+SEA）、糖尿病電刺激低頻組（DM+LEA）和糖尿病電刺激高頻組（DM+HEA）。利用鏈脲佐

2、菌素（STZ）溶液150mg/Kg的劑量進行腹腔注射，制備糖尿病小鼠模型。電針刺激部位為小鼠雙側后肢足三里穴（ST-36）。各組刺激參數：DM+SEA組僅給予針刺，不通電流；DM+LEA組給予10Hz、連續(xù)波1-3mA電流刺激；DM+HEA組給予100Hz、連續(xù)波1-3mA電流刺激。慢性刺激，30min/天，總共刺激8周。分別在造模前1周、成模后2周、4周、6周和8周記錄各組小鼠的血糖和體重的變化。8周后取各組小鼠的胃竇和胃體組織，采用

3、新鮮組織撕片技術制備可以全層染色標本，應用免疫熒光雙標技術觀察ICC在各組中的變化。
　　結果:（1）造模前5個組小鼠血糖水平沒有明顯差異；成模后及成模后第2周、4周、6周和8周，DM組、DM+SEA組、DM+LEA組和DM+HEA組小鼠血糖水平與正常組相比顯著升高，但糖尿病小鼠各組間無明顯差異；（2）造模前各組小鼠體重沒有明顯差異；成模后第2周、4周、6周和8周，DM組、DM+SEA組、DM+LEA組和DM+HEA組小鼠體重較正

4、常組相比都有明顯下降；與DM組相比，DM+LEA組從造模后第四周開始體重下降幅度有顯著差異，DM+HEA組則從造模后第八周體重下降幅度才有明顯差異；（3）正常組胃竇和胃體組織中肌間和肌內都可見豐富而明亮的Ano1陽性和c-Kit陽性細胞，Ano1+細胞和c-Kit+細胞幾乎可以完全重疊；與正常組相比，DM組胃竇和胃體組織肌間和肌內Ano1和c-Kit陽性細胞均顯著減少，而DM+LEA組和DM+HEA組則未見明顯變化；在DM組和DM+SE

5、A組中，c-Kit較Ano1減少更明顯，可見部分Ano1+c-Kitlow和Ano1+c-Kit-存在。
　　結論：（1）電針刺激對糖尿病小鼠血糖變化無調控作用；（2）電針刺激可以減少糖尿病小鼠體重的下降幅度，尤其是DM+LEA效果更佳；(3)同c-Kit相比，Ano1在糖尿病模型中標記ICC更具敏感性和特異性;（4）低頻和高頻電針刺激可以保護糖尿病小鼠胃竇和胃體組織中ICC網絡不被破壞。
　　第二部分:電針刺激對胃組織中m

6、SCF/Kit-ETV1信號的影響
　　目的:以糖尿病小鼠為模型，研究在電針刺激作用下，探討mSCF/Kit-ETV1信號通路是否參與電針對ICC網絡的保護性作用。
　　方法:應用免疫印跡法檢測mSCF、c-Kit、ETV1蛋白表達；應用RT-PCR檢測mSCF、c-Kit和ETV1mRNA表達；應用免疫熒光雙標c-Kit與ETV1定位ICC細胞與ETV1蛋白的表達。
　　結果:（1）Western blot結果顯示糖

7、尿病組小鼠胃竇和胃體mSCF、c-Kit及ETV1的蛋白表達量較正常組顯著降低，而糖尿病低頻刺激組和糖尿病高頻刺激組胃竇和胃體組織mSCF、c-Kit及ETV1的蛋白表達量較糖尿病組明顯增高；（2）RT-PCR結果顯示糖尿病組小鼠胃竇和胃體組織mSCF、c-Kit和ETV1的mRNA的表達量相對于正常組明顯降低，但糖尿病低頻刺激組和糖尿病高頻刺激組較糖尿病組mSCF、c-Kit和ETV1的mRNA的表達量卻顯著增高；（3）免疫熒光雙標結

8、果顯示在正常組ETV1的表達胃竇和胃體組織肌間極為豐富，相互連接形成網絡，緊鄰ICC網絡，與之伴行并伴有部分的重疊；在肌內ETV1表達在胃竇和胃體組織相對減少，其走形與肌細胞一致，大部分緊鄰伴隨ICC細胞的表達，可見部分重疊；在糖尿病組可見胃竇和胃體組織中肌間和肌內伴隨ICC網絡的中斷、減弱和消失，ETV1也表達明顯減少，甚至局部消失；然而，在糖尿病低頻刺激組和糖尿病高頻刺激組，ETV1表達同正常對照組一樣，形成豐富而鮮亮的ETV1網絡

9、與完整的ICC網絡毗鄰，并伴有部分重疊。
　　結論:糖尿病時胃組織中mSCF、c-Kit表達下調，導致ETV1缺失，進而致使ICC網絡破壞；在電針刺激作用下mSCF/Kit-ETV1信號可正常激活，維持ETV1的表達，進而保護ICC網絡。
　　第三部分:電針刺激對胃組織中HO-1陽性M2型巨噬細胞的影響
　　目的:以電針糖尿病小鼠為動物模型，觀察HO-1陽性M2型巨噬細胞是否參與電針對胃組織中ICC網絡的保護性作用機制

10、
　　方法:雄性C57BL/6小鼠60只，隨機分成正常對照組（Control group）、糖尿病組（DM group）、糖尿病假性刺激組（DM+SEA group）、糖尿病低頻刺激組（DM+LEA group）和糖尿病高頻刺激組（DM+HEA group）。成功制備糖尿病模型后，給予電針刺激干預，8周后取各組小鼠胃組織和血清。應用免疫熒光雙標技術觀察HO-1陽性巨噬細胞的表達；Western blot和RT-PCR技術檢測小鼠胃

11、組織HO-1和IL-10的表達情況；使用商業(yè)試劑盒評估各組血清丙二醛（MDA）的濃度；采用RT-PCR技術檢測M2型巨噬細胞標志物Arg-1和CD163及M1型巨噬細胞標志物iNOS的表達。
　　結果:（1）同正常對照組比，F4/80陽性巨噬細胞數量在DM組明顯增加；與DM組相比，DM+LEA組和DM+HEA組F4/80陽性巨噬細胞數量顯著減少。（2）HO-1陽性M2型巨噬細胞在正常對照組、DM組及DM+SEA組幾乎無表達，但在D

12、M+LEA組和DM+HEA組表達明顯增加。（3）Western blot結果顯示正常對照組、DM組及DM+SEA組HO-1和IL-10蛋白表達較低，而在DM+LEA組和DM+HEA組表達較高。（4）RT-PCR結果顯示正常對照組、DM組及DM+SEA組HO-1和IL-10mRNA表達較低，而在DM+LEA組和DM+HEA組表達較高。（5）跟正常對照組相比，DM組血清MDA水平可見明顯升高，而DM+LEA組和DM+HEA組血清MDA水平較