電針穴位刺激對糖尿病大鼠ENS的影響及機制研究.pdf

1、第一部分糖尿病大鼠ENS 變化及機制
　　 研究背景：糖尿病可導致胃腸功能紊亂，并可能存在ENS 腸神經元異常，但糖尿病時腸神經元異常及其發(fā)生機制尚不十分明確。膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（GDNF）及其下游信號途徑PI3K/Akt 可能在糖尿病腸神經元病變中起重要作用。
　　 目的：探討高糖狀態(tài)下腸神經元的損傷情況以及GDNF 及其下游信號途徑PI3K/Akt在腸神經元存活中的作用。
　　 方法：選取SD 雄性大鼠

2、32只，隨機分為正常對照組、糖尿病組（糖尿病4周組、糖尿病8周組、糖尿病12周組），每組8只。鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，對照組給予等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液注射。造模成功后按不同時間點分別取各組大鼠近端結腸和遠端結腸標本。P-Akt 作為 PI3K/Akt 信號通路檢測標志，PGP9.5作為腸道總神經元檢測標志。用real-time PCR，SABC 免疫組化法和Western blotting法分別檢測各組GDNF，p-A

3、kt和nNOS（神經元型一氧化氮合酶）神經元，CHAT（膽堿乙酰轉移酶）神經元及總神經元的mRNA和蛋白表達水平的變化。
　　 結果：
　　 （1）與正常對照組相比，近端結腸和遠端結腸GDNF的表達水平在糖尿病8周及糖尿病12周時均明顯下降。糖尿病12周GDNF的表達相比糖尿病8周時下降更為明顯。而糖尿病4周與對照組相比GDNF的表達無明顯差異。
　　 （2）p-Akt的表達變化趨勢與GDNF的表達變化相同，即p

4、-Akt的表達在糖尿病8周和糖尿病12周時與正常對照組相比存在明顯下降。
　　 （3）近端結腸和遠端結腸的nNOS 神經元，CHAT 神經元及總神經元數目也明顯減少。
　　 結論：糖尿病可導致腸神經元的顯著減少。GDNF 及其下游信號途徑PI3K/Akt作為腸神經元存活的重要信號通路之一可能在糖尿病腸神經元病變中發(fā)揮重要作用。
　　 第二部分電針刺激對糖尿病大鼠ENS的影響
　　 背景：電針刺激（EA）足

5、三里穴位已被應用于減輕胃腸道癥狀，改善胃腸動力。其具體作用機制尚不十分清楚，前一部分研究顯示糖尿病可致腸道神經元病變，但電針刺激是否影響ENS 有待于進一步研究。
　　 目的：以糖尿病大鼠為模型，研究電針刺激足三里穴位對受損的ENS 神經元的作用。初步探討EA 作用的胃腸道機制。
　　 方法：選取SD 雄性大鼠64只，隨機分為8組：正常對照組，糖尿病6周組，糖尿病+慢性高頻EA組，糖尿病+慢性低頻EA組，糖尿病+慢性假性

6、刺激組，糖尿病+急性高頻EA組，糖尿病+急性低頻EA組，糖尿病+急性假性刺激組，每組8只。鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，對照組給予等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液注射。高頻EA 參數為100HZ，1mA；低頻EA 參數為10HZ，1mA；假性刺激組為僅給予針刺，刺激時不通電。慢性EA組自糖尿病造模成功開始給予共6周EA，急性EA組為糖尿病第6周開始給予1周EA，刺激時間為30min/d。造模結束后分別取各組大鼠近端結腸和遠端結腸標本。

7、免疫組化染色觀察總神經元PGP9.5的表達。用免疫熒光雙重染色法觀察PGP9.5和nNOS或CHAT的雙重染色的神經元表達情況。用real-time和Western blotting 法分別檢測各組總神經元PGP9.5，代表性的抑制性神經元nNOS和興奮性神經元CHAT的mRNA和蛋白表達的變化。
　　 結果：總神經元和nNOS、CHAT 兩種神經元在近端結腸和遠端結腸的mRNA和蛋白表達在DM6周時均較正常對照組明顯下降。慢性

8、高頻EA組與DM組和DM+其他EA組相比，總神經元，nNOS、CHAT 兩種神經元的表達在近端結腸和遠端結腸均明顯增加。
　　 結論：慢性高頻電針刺激足三里可使糖尿病大鼠損傷的腸道神經元發(fā)生修復。
　　 第三部分電針刺激對糖尿病大鼠ENS 影響的機制
　　 研究背景：第二部分研究顯示慢性高頻電針刺激對糖尿病大鼠結腸受損的腸神經元有修復作用，但其具體作用機制尚不清楚。第一部分研究結果提示GDNF 及下游信號途徑PI

9、3K/Akt 作為腸神經元存活的重要信號通路之一在糖尿病腸神經元病變中可能發(fā)揮重要作用，但其是否參與電針刺激對神經元病變的修復需進一步研究。
　　 目的：以糖尿病大鼠為模型，研究電針刺激足三里穴位對受損的ENS 神經元修復的可能機制。
　　 方法：選取SD 雄性大鼠64只，隨機分為8組：正常對照組，糖尿病6周組，糖尿病+慢性高頻EA組，糖尿病+慢性低頻EA組，糖尿病+慢性假性刺激組，糖尿病+急性高頻EA組，糖尿病+急性低

10、頻EA組，糖尿病+急性假性刺激組，每組8只。鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，對照組給予等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液注射。高頻EA 參數為100HZ，1mA；低頻EA 參數為10HZ，1mA；假性刺激組為僅給予針刺，刺激時不通電。慢性EA組自糖尿病造模成功開始給予共6周EA，急性EA組為糖尿病第6周開始給予1周EA，刺激時間為30min/d。造模結束后分別取各組大鼠近端結腸和遠端結腸標本。用real-time和Western blot