伯氏瘧原蟲(chóng)新型傳播阻斷疫苗候選蛋白PbA_320與PbA_100的確定.pdf

1、目的：
　　瘧疾(Malaria)是瘧原蟲(chóng)經(jīng)媒介按蚊叮咬而傳播的一種蟲(chóng)媒傳染病，是最為致命的原蟲(chóng)感染性疾病。每年約造成60萬(wàn)人死亡，瘧疾已成為全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，給全球尤其是發(fā)展中國(guó)家?guī)?lái)了沉重的健康危害和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管因應(yīng)用最新推出的以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法(ACTs)，瘧疾的死亡率已經(jīng)大大降低，但最近在東南亞一些國(guó)家發(fā)現(xiàn)了針對(duì)青蒿素這一聯(lián)合療法的主要成分所產(chǎn)生的耐藥性的現(xiàn)象。這就使得研發(fā)安全有效的瘧疾疫苗成為當(dāng)

2、前全球瘧疾防治的迫切需求。目前，正在研究的瘧疾疫苗主要包括紅前期疫苗、紅內(nèi)期疫苗和傳播阻斷疫苗。其中傳播阻斷疫苗(Transmission Blocking Vaccine，TBV)被認(rèn)為是一種在瘧疾流行地區(qū)降低病原體傳播的可行策略，其基本原理是用瘧原蟲(chóng)有性階段和蚊階段的表面抗原免疫個(gè)體，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，抗體隨血液被蚊吸食后，可阻止瘧原蟲(chóng)在蚊體內(nèi)的后續(xù)發(fā)育，從而切斷瘧原蟲(chóng)的傳播。TBV候選抗原主要分為配子受精前期靶抗原、受精后期靶抗原和蚊

3、蟲(chóng)中腸靶抗原，因候選抗原不受脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)選擇壓力的影響，而顯示出較低的多態(tài)水平，抗原不易出現(xiàn)變異的情況，更有利于疫苗的免疫效果，因此TBV是瘧疾疫苗研究的熱點(diǎn)。目前，已研究發(fā)現(xiàn)了一些具有傳播阻斷作用的TBV抗原，但數(shù)量有限，且這些候選抗原均存在一定的缺陷，不能完全阻斷瘧疾的傳播。因此，篩選并增加新型瘧原蟲(chóng)TBV候選抗原尤為重要。
　　本試驗(yàn)選取了伯氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodium berghei)有性發(fā)育階段的特異性膜蛋白PbA

4、_320(PBANKA_114320)與PbA_100（PBANKA_093100），應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PbA_320蛋白，應(yīng)用畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PbA_100蛋白。分別將兩者免疫小鼠后，獲取免疫血清以確定候選抗原的表達(dá)階段及傳播阻斷能力。同時(shí)，應(yīng)用基因敲除技術(shù)靶向敲除了pba_320與pba_100基因，對(duì)兩者的生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究，以期為傳播阻斷疫苗的進(jìn)一步研究提供參考。
　　方法：
　　一、生物信息學(xué)分析

5、　　采用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)伯氏瘧原蟲(chóng)傳播阻斷疫苗的候選蛋白PbA320、PbA100的功能域進(jìn)行預(yù)測(cè);采用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)（http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pldu）進(jìn)行抗原決定簇的預(yù)測(cè)。
　　二、原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的獲取
　　1、伯氏瘧原蟲(chóng)cDNA的獲取
　　伯氏瘧原蟲(chóng)感染6-8周的雌性的BALB/c

6、小鼠，感染后第四天小鼠眼球取血，提取瘧原蟲(chóng)的RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，獲得瘧原蟲(chóng)基因組cDNA。
　　2、應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增目的基因片段
　　根據(jù)目的片段設(shè)計(jì)帶有BamHⅠ與NotⅠ酶切位點(diǎn)的引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得大量的目的片段
　　3、PCR產(chǎn)物的純化
　　根據(jù)瓊脂糖凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)瓊脂糖凝膠電泳后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收與純化。
　　4、原核表達(dá)載體的構(gòu)建
　

7、　選擇在大腸桿菌中可以大量表達(dá)的原核載體PET32a(+)作為表達(dá)載體，將目的片段克隆至載體，并導(dǎo)入大腸桿菌DH5a中，通過(guò)PCR鑒定、酶切鑒定及測(cè)序鑒定，最終獲得構(gòu)建正確的表達(dá)載體PET32a-320。
　　5、原核重組蛋白的表達(dá)及純化
　　將測(cè)序鑒定正確的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入蛋白表達(dá)菌株Rosetta-gami B(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定正確后，收集重組蛋白并進(jìn)行純化。
　

8、　三、酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的獲取
　　1、目的基因的擴(kuò)增及載體構(gòu)建
　　應(yīng)用上述方法獲取伯氏瘧原蟲(chóng)cDNA，根據(jù)目的片段設(shè)計(jì)引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得大量的目的片段。將基因片段克隆至酵母表達(dá)載體PPIC3.5K，構(gòu)建載體PPIC3.5K-pba_100，并對(duì)載體進(jìn)行鑒定。
　　2、質(zhì)粒大量制備
　　將構(gòu)建正確的表達(dá)載體PPIC3.5K-pba_100轉(zhuǎn)化至TOP10菌株中，并對(duì)轉(zhuǎn)化成功的菌株進(jìn)行鑒

9、定。鑒定正確后進(jìn)行質(zhì)粒大提，將質(zhì)粒濃度調(diào)整至10 ug/ul左右。
　　3、表達(dá)載體的電轉(zhuǎn)化
　　制備GS115細(xì)胞感受態(tài)，并將細(xì)胞在YPG液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將PPIC3.5K-pba_100質(zhì)粒用Sac1酶進(jìn)行線性化，回收后用Eppendorf電轉(zhuǎn)化儀電轉(zhuǎn)化PPIC3.5K-pba_100于GS115感受態(tài)中，涂布150 uL轉(zhuǎn)化后的菌液于RDB+G418平板上。
　　4、PPIC3.5K-pba_100的表達(dá)

10、>　　挑取RDB+G418平板上的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，將PCR鑒定為陽(yáng)性的菌株在YPG液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，靜置5-6小時(shí)，倒掉試管中的上清，加入含1％甲醇的YP培養(yǎng)24h。經(jīng)5％甲醇的YP進(jìn)行誘導(dǎo)24h后，裂解細(xì)胞，對(duì)裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳確定表達(dá)量。
　　5、搖瓶發(fā)酵與蛋白純化
　　將上述表達(dá)量較高的菌株進(jìn)行大量發(fā)酵培養(yǎng)，收集培養(yǎng)后的細(xì)菌，裂解細(xì)菌后用透析柱將上清濃縮至200mL，并進(jìn)行下一步的蛋白純化。

11、r>　　四、重組蛋白的動(dòng)物免疫及抗血清的獲得
　　1、動(dòng)物免疫
　　6-8周的雌性的BALB/c小鼠15只，分成3組，每組5只，1、2組分別注射兩種重組蛋白，3組注射空載體蛋白作為對(duì)照組。初次免疫與加強(qiáng)免疫間隔2星期，共免疫三次。
　　2、免疫血清的收集及血清特異性抗體滴度的檢測(cè)
　　第三次免疫后第十天取少量尾血獲得少量血清，用酶聯(lián)免疫吸附的方法檢測(cè)血清中的抗體滴度。待抗體滴度有大幅度提升后，將小鼠眼球取血獲得大

12、量抗血清進(jìn)行后續(xù)定位及阻斷試驗(yàn)。
　　五、PbA_320、PbA_100蛋白表達(dá)階段的確定
　　通過(guò)Western blot（免疫印跡法）及IFA（間接免疫熒光法）對(duì)目的基因進(jìn)行定位。
　　結(jié)果：
　　一、原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)與純化
　　通過(guò)PCR方法成功獲取了pba_320基因片段(579 bp)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，對(duì)比DL2000 Marker，大小與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。使用瓊脂

13、糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。用BamHⅠ與NotⅠ酶對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行酶切，得到帶有酶切位點(diǎn)的目的片段。將空的原核載體PET32a(+)用BamHⅠ與NotⅠ雙酶切后，得到末端與目的片段末端一致的線狀空載體。使用連接酶SolutionⅠ將空載體與目的片段相連接，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后得到重組質(zhì)粒P ET32a-pba-320。
　　將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta-gami B(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后裂解細(xì)菌，收集上清液。將收

14、集的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，表達(dá)后的蛋白與預(yù)測(cè)蛋白大小一致。大量收集樣品，使用鎳氨三乙酸瓊脂糖柱進(jìn)行純化，得到大量高純度的重組蛋白。
　　二、酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白純化
　　通過(guò)PCR方法獲得大量的目的片段，成功將基因片段克隆至酵母表達(dá)載體PPIC3.5K，完成了載體PPIC3.5K-pba_100的構(gòu)建，經(jīng)酶切與測(cè)序鑒定，載體構(gòu)建正確。
　　成功制備GS115細(xì)胞感受態(tài)，并將線性化的PPIC3.5K

15、-pba_100質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至GS115感受態(tài)中。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，經(jīng)5％甲醇的YP進(jìn)行誘導(dǎo)24 h后目的蛋白得到了大量表達(dá)。經(jīng)純化后得到了80％純度的目的蛋白。
　　三、重組蛋白的免疫原性檢測(cè)
　　分別用PbA_320、PbA_100免疫小鼠，經(jīng)三次免疫后收集血清。用重組蛋白包板，ELISA檢測(cè)動(dòng)物免疫血清的抗體滴度，結(jié)果顯示兩個(gè)重組蛋白的抗體水平均有大幅度提高，表明重組蛋白具有較好的免疫原性。
　　四、Pb

16、A_320、PbA_100基因的定位
　　采用Western blot及IFA方法檢測(cè)兩種重組蛋白在瘧原蟲(chóng)發(fā)育的表達(dá)階段。結(jié)果顯示兩個(gè)目的基因在裂殖體、配子體、動(dòng)合子三個(gè)階段均有表達(dá)。
　　五、候選蛋白的阻斷能力
　　分別用PbA320、PbA100免疫血清在體外培養(yǎng)動(dòng)合子，用抗Pbs21抗體來(lái)標(biāo)記動(dòng)合子，在熒光顯微鏡下觀察動(dòng)合子數(shù)量。結(jié)果顯示，抗PbA_320抗血清與抗PbA_100抗血清均能明顯減少動(dòng)合子的形成，與

17、對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　六、基因的功能性研究
　　應(yīng)用同源重組的方法，分別將候選基因pba_320與pba_100從瘧原蟲(chóng)的基因組中敲除，分別獲得了pba_320與pba_100基因缺失型的瘧原蟲(chóng)。生物學(xué)功能研究結(jié)果顯示，PbA_320對(duì)瘧原蟲(chóng)的瘧疾血癥與小鼠鼠的生存率無(wú)明顯影響，但對(duì)配子體出絲有重要影響。PbA_100對(duì)瘧原蟲(chóng)的瘧疾血癥與小鼠鼠的生存率無(wú)明顯影響，但其缺失可減少部分動(dòng)合子的形成。
　　結(jié)論：<

18、br>　　1、PbA_320與PbA_100蛋白均具有良好的抗原性。
　　2、PbA_320與PbA_100蛋白在裂殖體、配子體、動(dòng)合子三個(gè)階段均有表達(dá)。
　　3、抗PbA_320抗體可減少配子體出絲及動(dòng)合子的形成，抗PbA_100抗體可減少動(dòng)合子的形成。
　　4、成功獲得了基因敲除型瘧原蟲(chóng)株△pba_320與Apba_100。
　　5、PbA_320可影響配子體出絲;PbA_100對(duì)動(dòng)合子的形成有重要影響。兩者