魔芋HOGS抗病毒特性及作用機(jī)理研究.pdf

1、隨著人們對(duì)健康的日益關(guān)注，安全、有效、特異的抗病毒生化藥物研究成為熱點(diǎn)。多糖作為生物活性物質(zhì)能夠提高機(jī)體免疫力，并具有低毒和低耐藥性等特點(diǎn)，其中，硫酸化多糖又不同于一般多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，而是通過其硫酸聚陰離子對(duì)病毒感染細(xì)胞進(jìn)行抑制作用發(fā)揮更強(qiáng)的抗病毒活性，顯示了廣闊的抗病毒藥物開發(fā)前景。為此，本論文以我國(guó)西部豐富的特產(chǎn)資源魔芋葡甘聚糖(NonjacGlucomannan，KGM)為原料，在已有的丙酯和硫酸酯化基礎(chǔ)上，采用離子交換樹脂層

2、析對(duì)制備得到的魔芋葡甘低聚糖醛酸丙酯硫酸酯(HydroxylpropylOligo-konjacGlucomannannuroateSulfate，HOGS)分離純化，并運(yùn)用葡聚糖凝膠層析、醋酸纖維素薄膜電泳及高效液相色譜鑒定其純度。采用氣相色譜(GC)、凝膠滲透色譜(GPC)、傅立葉紅外光譜(FT-IR)、激光拉曼光譜(RAMAN)、光電子能譜(XPS)和高分辨1H核磁共振波譜(1H-NMR)等現(xiàn)代分析手段和技術(shù)，對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。

3、通過MTT法測(cè)定HOGS的各種病毒研究對(duì)象的宿主細(xì)胞Hela、Vero、HepG2-2.2.15、MDCK的細(xì)胞毒性，確定其最大無毒濃度。按直接抑制病毒包膜蛋白、抑制病毒在胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)、抑制病毒吸附細(xì)胞和阻斷病毒受體(保護(hù)細(xì)胞不受病毒侵染)四種不同作用方式分組進(jìn)行抗病毒特性研究。通過細(xì)胞病變(CPE)觀察、MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率等方法確定HOGS抗柯薩奇3型病毒、脊髓灰質(zhì)炎I型病毒的作用特性；通過ELASA法測(cè)定乙肝表面抗原(HBsA

4、g)、e抗原(HBeAg)的含量、熒光定量PCR法檢測(cè)病毒DNA含量等方法研究HOGS抑制乙肝病毒抗原表達(dá)和DNA復(fù)制的過程；通過血凝活性、病毒表面神經(jīng)氨酸酶活性測(cè)定及熒光RT-PCR法檢測(cè)病毒RNA含量等方法研究HOGS抗甲型流感病毒血凝效價(jià)，直接抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞后釋放、擴(kuò)散和在胞內(nèi)復(fù)制過程的作用機(jī)理。 研究的主要結(jié)果如下： (1)二次硫酸化制備的HOGS經(jīng)過乙醇二次沉淀后采用離子交換樹脂將硫酸化與未硫酸化的樣品分離純

5、化，結(jié)果顯示，離子交換洗脫曲線出現(xiàn)的糖峰為單一峰，表明硫酸化HOGS組分均一，達(dá)到了分離純化的目的。葡聚糖凝膠層析純度鑒定結(jié)果顯示，洗脫曲線出現(xiàn)的糖峰為單一對(duì)稱峰，可以判斷HOGS為分子大小和形狀均一的組分；醋酸纖維膜電泳結(jié)果為一條單一譜帶，樣品已達(dá)到電泳純，表明樣品是單一組分；高效液相色譜圖結(jié)果顯示，經(jīng)過離子交換純化的HOGS得到單一樣品峰，表明其雜質(zhì)含量較低，面積歸一化法計(jì)算純度為96.39±0.52％。分離純化及純度鑒定表明HOG

6、S已達(dá)到較高純度，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 (2)硫酸化多糖的結(jié)構(gòu)顯著影響其抗病毒活性。氣相色譜法分析HOGS的魔芋葡甘低聚糖部分由甘露糖、葡萄糖聚合而成，其摩爾比約為：Man：Glu=1.8:1。凝膠滲透色譜分子量分布測(cè)定結(jié)果顯示，色譜圖呈正態(tài)分布，多分散系數(shù)MW/Mn=1.01，HOGS的相對(duì)分子質(zhì)量峰值Mp為1608D，重均相對(duì)分子質(zhì)量MW為1595D，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量Mn為1572D，相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度指數(shù)0n為3.62×

7、104，制得的HOGS純品為一種相對(duì)分子質(zhì)量分布很窄的硫酸化多糖。FT-IR和RAMAN結(jié)果顯示，由于硫酸基團(tuán)特征吸收峰的出現(xiàn)，分子已接上硫酸基團(tuán)。XPS分析顯示，HOGS已引入硫元素，純化HOGS的S元素的相對(duì)含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58.79％，其S元素含量與未純化HOGS相比，提高約40％，同時(shí)，對(duì)S2P進(jìn)行曲線擬合，根據(jù)結(jié)合能數(shù)據(jù)分析，對(duì)于S原子僅可能以-OSO3-形式存在。1H-NMR分析顯示，糖環(huán)的C2和C3位在硫酸化修飾后，化學(xué)位移

8、發(fā)生漂移變化，提示硫酸基可能連接在C2和C3位，而且甲基氫的化學(xué)位移發(fā)生改變，表明在C6位連接的羥丙基上的羥基可能接有硫酸基團(tuán)。 (3)HOGS阻斷CVB3病毒侵染作用研究結(jié)果表明，HOGS分別與細(xì)胞作用4h、24h，再加入CVB3，能夠顯著減輕細(xì)胞病變程度，減少病變細(xì)胞數(shù)量，對(duì)CVB3侵染細(xì)胞起到一定的阻斷作用，保護(hù)了Hela細(xì)胞不受病毒的感染，且隨著HOGS濃度的增加，其保護(hù)細(xì)胞作用增強(qiáng)。 根據(jù)細(xì)胞存活率計(jì)算半數(shù)抑制

9、濃度IC50及抑制指數(shù)TI，阻斷病毒侵染組(4h)：IC50為0.1483mg/mL，TI值為4.50；阻斷病毒侵染組(24h)：IC50為0.1517mg/mL，TI值為4.40。直接抑制病毒組(1h)：IC50為0.2338mg/mL，TI值為2.86；直接抑制病毒組(3h)：IC50為0.2242mg/mL，TI值為2.97；直接抑制病毒組(5h)：IC50為0.2445mg/mL，TI值為2.73。結(jié)果顯示HOGS在阻斷CVB3

10、侵染細(xì)胞的作用下，HOGS抗CVB3的抑制指數(shù)TI較高，抑制效果較好。初步推斷可能是HOGS競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合了細(xì)胞表面的柯薩奇病毒受體所致。 (4)HOGS抑制PV1病毒胞內(nèi)復(fù)制作用研究結(jié)果表明，PV1病毒先感染細(xì)胞，作用2h后，再加入HOGS，對(duì)細(xì)胞病變的程度和數(shù)量均有明顯的抑制作用，即使在較低的濃度下，細(xì)胞病變也能受到有效抑制，說明HOGS抑制PV1的主要作用特性是在PV1進(jìn)入細(xì)胞后，對(duì)其RNA在胞內(nèi)的釋放和生物合成過程的抑制作用。

11、 選擇分組試驗(yàn)中效果較好的兩組，即抑制PV1胞內(nèi)復(fù)制和保護(hù)細(xì)胞兩組，進(jìn)一步比較其抑制細(xì)胞病變效果，確定最小有效濃度：CPE結(jié)果顯示，PV1作用Vero細(xì)胞2h后，再加入HOGS一組的細(xì)胞病變明顯少于另一組，進(jìn)一步說明HOGS抗PV1的主要作用特性是通過抑制病毒RNA在胞內(nèi)的釋放和復(fù)制過程，影響PV1在細(xì)胞內(nèi)的增殖，最小有效濃度為0.0095mg/mL。 (5)HOGS對(duì)HBV抗原(HBsAg、HBeAg)表達(dá)的抑制作用顯

12、示：作用120h，最大無毒濃度HOGS對(duì)HBsAg的抑制率為65.27±5.04％，抑制HBsAg表達(dá)效果優(yōu)于對(duì)照藥物IFNα-2b，半數(shù)有效濃度IC50為0.2675mg/mL，抑制指數(shù)TI為5.52。各濃度HOGS對(duì)HBeAg的抑制作用不顯著。作用120h，最大無毒濃度HOGS抑制率為14.76±3.01％，抑制效果小于IFNα-2b。 HOGS對(duì)HBV-DNA復(fù)制的抑制作用顯示：作用144h，最大無毒濃度的HOGS對(duì)胞外H

13、BV-DNA的抑制率為37.04±3.11％；作用144h，最大無毒濃度的HOGS對(duì)胞內(nèi)的HBV-DNA的抑制率為59.25±6.32％。說明HOGS對(duì)HBV-DNA的復(fù)制和釋放均具有一定抑制作用，且對(duì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的抑制效果更顯著。 提示HOGS抗乙肝病毒的作用特性是抑制了HBV-DNA的復(fù)制水平(轉(zhuǎn)錄前水平)，或干擾了包括逆轉(zhuǎn)錄酶和抗原在內(nèi)的蛋白質(zhì)合成及后加工。 (6)HOGS分組抑制IAV病毒血凝活性(血凝效價(jià))結(jié)

14、果顯示：病毒與細(xì)胞先作用8h，后加HOGS試驗(yàn)組血凝效價(jià)與病毒組比較，顯著降低，最大無毒濃度HOGS組的病毒血凝效價(jià)由128下降到4，說明HOGS能明顯減輕病毒感染細(xì)胞后，在胞內(nèi)釋放、擴(kuò)散和復(fù)制的過程。HOGS先與病毒作用2h，再加入細(xì)胞試驗(yàn)組在一定程度上降低病毒的血凝效價(jià)，與病毒組比較，血凝效價(jià)從320降低到24，說明HOGS可能通過直接抑制病毒包膜蛋白來減輕病毒進(jìn)入細(xì)胞后，顆粒的釋放、擴(kuò)散，使新的病毒顆粒產(chǎn)生自我凝集，從而減少病毒的

15、數(shù)量。 選擇上述兩組，進(jìn)一步比較抗病毒活性，根據(jù)CPE觀察，細(xì)胞先感染病毒，再加HOGS一組，最小有效濃度為0.0625mn/mL；HOGS與病毒作用2h后，再感染細(xì)胞一組，最小有效濃度為0.03125mg/mL。 HOGS抑制流感病毒表面神經(jīng)氨酸酶活性結(jié)果顯示，隨著濃度的增加，其抑制NA活性增強(qiáng)，最高抑制率可達(dá)53±2.47％，說明HOGS體外抑制甲型流感病毒的機(jī)理之一是通過對(duì)流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)釋放、擴(kuò)散過

16、程的阻斷實(shí)現(xiàn)病毒顆粒的自我凝集作用。HOGS抑制病毒RNA復(fù)制結(jié)果顯示：最大無毒濃度HOGS作用下，144h后，對(duì)甲型流感病毒在細(xì)胞內(nèi)總RNA合成的抑制率達(dá)到59.25±6.32％以上，效果明顯，說明HOGS體外抑制甲型流感病毒機(jī)理的另一方面是在病毒吸附和侵入宿主細(xì)胞后，對(duì)病毒在細(xì)胞內(nèi)RNA合成過程的抑制。 通過HOGS在體外對(duì)不同類型病毒的抗病毒特性研究，證實(shí)HOGS能夠通過多種方式抑制病毒，其作用特性大致有3種，即與細(xì)胞表面