TLR7在HCV感染過(guò)程中的免疫激活及胞內(nèi)區(qū)功能研究.pdf

1、HCV是一種正單鏈RNA 病毒，能夠通過(guò)感染宿主細(xì)胞，引發(fā)機(jī)體病毒性肝炎、肝纖維化乃至肝癌的發(fā)生。HCV的感染往往伴隨機(jī)體因天然免疫而引發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)，此過(guò)程有眾多模式識(shí)別受體的參與。Toll樣受體是一類(lèi)通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式，介導(dǎo)機(jī)體天然免疫，并能作為橋梁連接機(jī)體天然免疫與獲得性免疫的一類(lèi)重要模式識(shí)別受體。Tol l 樣受體能夠識(shí)別多種病原微生物的固有成分，介導(dǎo)機(jī)體針對(duì)多種病原菌與病毒的免疫反應(yīng)。TLR7 存在于細(xì)胞內(nèi)體表面，通過(guò)

2、識(shí)別包括I 型HIV、手足口病及A 型流感病毒在內(nèi)的多種單鏈RNA 病毒，介導(dǎo)機(jī)體抗病毒免疫。TLR7 被其配體激活后，通過(guò)下游接頭蛋白分子MyD88 將激活信號(hào)向下游傳遞，最終激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，進(jìn)而產(chǎn)生多種促炎因子與I 型干擾素，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)。TLR7 屬于I 型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)與胞內(nèi)區(qū)組成。其胞外區(qū)由多個(gè)富含亮氨酸的LRR 區(qū)組成，主要參與TLR7與其配體的識(shí)別，跨膜區(qū)主要負(fù)責(zé)TLR7分子的錨定，而胞內(nèi)區(qū)則負(fù)責(zé)T

3、LR7激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。目前雖然研究發(fā)現(xiàn)多種單鏈RNA 病毒感染所激活的天然免疫反應(yīng)均有TLR7分子參與，但在HCV 感染機(jī)體所引起的天然免疫應(yīng)答過(guò)程中，TLR7的所起的作用尚不明確。此外，雖然TLR7分子通過(guò)其胞內(nèi)區(qū)將激活信號(hào)向下傳遞，但TLR7分子胞內(nèi)區(qū)介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體機(jī)制還不清楚。根據(jù)以上研究背景，本研究從HCV 感染所激活機(jī)體天然免疫反應(yīng)入手，闡明TLR7在HCV 感染過(guò)程中的作用，并進(jìn)一步從蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)影響功能的角度，解釋了

4、TLR7 被激活后通過(guò)胞內(nèi)區(qū)進(jìn)行信號(hào)傳遞的具體機(jī)制。因此本研究主要從HCV 感染過(guò)程中TLR7分子的作用與TLR7分子胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)對(duì)信號(hào)傳遞的影響兩個(gè)方面，分為如下兩個(gè)部分進(jìn)行：
　　 1.HCV 感染過(guò)程中TLR7分子的作用：
　　 本研究首先利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCV基因組的Huh7細(xì)胞所表達(dá)的HCV 全基因組RNA刺激外周血單核細(xì)胞（PBMCs），通過(guò)ELISA 檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)HCV基因組RNA能夠刺激PBMC

5、s 顯著上調(diào)TNF-α與IFN-α。因此證實(shí)HCV 可以通過(guò)其單鏈RNA基因組激活機(jī)體天然免疫反應(yīng)。由于TLR7天然狀態(tài)下的配體為單鏈RNA病毒，因此該激活很可能通過(guò)TLR7 介導(dǎo)。由于在細(xì)胞內(nèi)體中病毒基因組將被降解成許多大小不等的寡聚核苷酸片段（ORNs），因此我們根據(jù)TLR7 識(shí)別序列特點(diǎn)，以HCV基因組為模板人工合成多條ORNs，并用這些ORNs 刺激新分離的PBMCs細(xì)胞，通過(guò)ELISA 檢測(cè)我們證實(shí)位于1000位的ORN100

6、0與位于HCV 3’端尾部的ORNHCVtail能夠刺激PBMCs上調(diào)TNF-α與IFN-α的表達(dá)。TLR7 被配體激活后將活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B與IRF7，從而啟動(dòng)基因的表達(dá)。因此，我們利用人工合成的ORNs 刺激Huh7細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)ORN1000與ORNHCVtail 可以激活NF-κ B與IRF7。為了確定TLR7是否真的參與HCV 感染過(guò)程所引起的免疫激活，我們通過(guò)RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)當(dāng)TLR7 被干

7、擾時(shí)，ORNs 刺激細(xì)胞所造成NF-κ B的激活強(qiáng)度明顯下降。而通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使TLR7 過(guò)表達(dá)后，NF-κ B的激活強(qiáng)度顯著提高。因此，我們確定HCV基因組片段對(duì)于機(jī)體天然免疫反應(yīng)的激活能夠通過(guò)TLR7 進(jìn)行的。
　　 2.TLR7分子結(jié)構(gòu)對(duì)信號(hào)傳遞的影響：
　　 TLR7分子被激活后能夠通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活基因表達(dá)。雖然TLR7通過(guò)胞內(nèi)區(qū)募集接頭蛋白MyD88 從而激活信號(hào)通路已比較清楚，然而該分子具體通過(guò)胞內(nèi)

8、區(qū)哪些位點(diǎn)介導(dǎo)對(duì)MyD88的募集卻尚無(wú)定論。因此我們對(duì)TLR7 胞內(nèi)區(qū)蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以期篩選出對(duì)TLR7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起關(guān)鍵作用位點(diǎn)，并解釋其產(chǎn)生作用的機(jī)制。首先，我們分析了TLR7 胞內(nèi)區(qū)的序列特征，并且構(gòu)建了胞內(nèi)區(qū)全長(zhǎng)與半長(zhǎng)缺失體的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)對(duì)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)NF-κ B的激活情況，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染TLR7 胞內(nèi)區(qū)全長(zhǎng)與半長(zhǎng)缺失體的實(shí)驗(yàn)組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的陰性對(duì)照組之間均無(wú)差別，因此我們將TLR7 胞內(nèi)區(qū)的關(guān)鍵位點(diǎn)鎖定在胞

9、內(nèi)區(qū)的后半段。接著，我們?cè)诎麅?nèi)區(qū)后半段以大約20個(gè)氨基酸為間隔構(gòu)建了一系列的缺失質(zhì)粒。通過(guò)檢測(cè)NF-κ B 激活情況，我們將關(guān)鍵位點(diǎn)鎖定在一個(gè)含有16個(gè)氨基酸的區(qū)域。然后，我們通過(guò)一系列位點(diǎn)特異性點(diǎn)突變的方法，證明這16個(gè)氨基酸中存在2個(gè)分別位于1004位與1006 位的精氨酸能夠?qū)LR7 功能產(chǎn)生影響。最后我們通過(guò)免疫共沉淀的方法證明，這2個(gè)精氨酸中只有1004 位的精氨酸是通過(guò)影響TLR7與下游接頭蛋白MyD88的結(jié)合來(lái)影響TLR