不可分型流感嗜血桿菌在呼吸道感染中的免疫應(yīng)答及細(xì)胞內(nèi)受體TLR9在感染中的表達(dá)研究.pdf

1、高級(jí)脊椎動(dòng)物發(fā)展了兩套保護(hù)性免疫系統(tǒng)，天然免疫和獲得性免疫。天然免疫系統(tǒng)主要依賴于通過(guò)感知病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)的蛋白質(zhì)識(shí)別病原體。TLRs(toll-likereceptors)是研究較多的模式識(shí)別受體，TLR識(shí)別一系列的細(xì)菌、真菌及病毒產(chǎn)物，TLR9與其他LTRs不同，存在于細(xì)胞內(nèi)，識(shí)別細(xì)胞內(nèi)非甲基化細(xì)菌DNA。
　　 呼吸道感染與不可分型流

2、感嗜血桿菌(non-typeableHaemophilusInfluenza，NHTi)具有相關(guān)性，特別是肺部及中耳細(xì)菌感染，具有一定的發(fā)病率及死亡率。NTHi是一種無(wú)莢膜的革蘭氏陰性多形桿菌，常定植于大多數(shù)人的上氣道，在機(jī)體氣道表面受損或在粘液纖毛清除功能散失時(shí)常常引起機(jī)會(huì)性感染的病原體。NTHi傳統(tǒng)意義上被認(rèn)為是一種非侵入性的細(xì)胞外細(xì)菌，但近期研究表明，NTHi可內(nèi)化至真核細(xì)胞內(nèi)，侵入上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)生存，從而躲避抗菌素

3、的殺菌活性。
　　 我們應(yīng)用抗菌素保護(hù)策略，將細(xì)胞同NTHi共孵育2h后；通過(guò)高清顯微鏡直觀的觀察NTHi進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，NTHi可在胞外產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的同時(shí)，內(nèi)化入細(xì)胞內(nèi)，故NTHi同時(shí)作為兼性胞內(nèi)菌存在；同時(shí)，我們構(gòu)建了急性肺部NTHi感染模型，應(yīng)用原位雜交技術(shù)，在NTHi刺激ALIM4h后，在肺泡腔內(nèi)可檢測(cè)到NTHi的存在。
　　 應(yīng)用APA策略，定量檢測(cè)到NTHi刺激后人上皮細(xì)胞A549及外周血單核細(xì)胞及肺組織后產(chǎn)生

4、的炎癥因子IL-8和/或TNF-a水平，總炎癥因子與胞內(nèi)NTHi產(chǎn)生的炎癥因子比較，胞內(nèi)菌炎癥因子處于非優(yōu)勢(shì)地位。ALIM經(jīng)NTHi刺激后有炎癥因子的釋放?；钚訬THi所產(chǎn)生炎癥效應(yīng)同滅活菌比較無(wú)顯著差異；細(xì)菌成分如細(xì)菌DNA，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，此作用可被核內(nèi)體成熟抑制劑氯喹阻斷。
　　 將活性NTHi、滅活的NTHi及細(xì)菌DNA刺激上皮細(xì)胞A549及外周血單核細(xì)胞及ALIM后，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TLR9mRNA在

5、細(xì)菌或細(xì)菌組分刺激后的肺組織、外周血單核細(xì)胞上有表達(dá)，而在刺激后的上皮細(xì)胞A549中的無(wú)表達(dá)；在RT-PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TLR9在外周血單核細(xì)胞中經(jīng)活性NTHi及細(xì)菌DNA激活后有表達(dá)增加，氯喹可抑制TLR9的表達(dá)，而肺泡上皮細(xì)胞A549經(jīng)活性NTHi及細(xì)菌DNA刺激不表達(dá)TLR9蛋白；Westernblot檢測(cè)，ALIM肺組織經(jīng)活性NTHi、細(xì)菌DNA及合成的ODNM362刺激后的TLR9有上調(diào)，MAPKp38p及E

6、RKp44/42信號(hào)通路參與了TLR9的表達(dá)。
　　 上述結(jié)果表明，氣道及細(xì)胞對(duì)細(xì)菌株的不同應(yīng)答跟細(xì)胞反應(yīng)類型或菌種相關(guān)，并不跟細(xì)菌的數(shù)量完全相關(guān)。NTHi為傳統(tǒng)意義上被認(rèn)為是胞外菌，我們的實(shí)驗(yàn)表明NTHi不但能進(jìn)入胞內(nèi)，且不單純居留在胞內(nèi)以躲避抗菌素的殺菌作用，同時(shí)仍有一定水平的炎癥因子的釋放，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)；細(xì)胞內(nèi)NTHi刺激細(xì)胞表達(dá)IL-8及TNF-a的水平大概相當(dāng)于NTHi刺激細(xì)胞總炎癥介質(zhì)水平的10％至30%。除活性NT

7、Hi外，熱滅活或慶大霉素滅活的NTHi在刺激肺泡上皮細(xì)胞或單核細(xì)胞及肺組織后，仍可致炎癥介質(zhì)IL-8或TNF-a表達(dá)增加。細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌及細(xì)菌DNA、合成的ODN對(duì)機(jī)體TLR9介導(dǎo)的單核細(xì)胞抗NTHi炎癥防御有一定的作用，且可受氯喹調(diào)控。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)TLR9mRNA在細(xì)菌或細(xì)菌組分刺激后的肺組織、外周血單核細(xì)胞上有表達(dá)，而在刺激后的上皮細(xì)胞A549中的無(wú)表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)TLR9在外周血單核細(xì)胞中在活性NTHi及細(xì)菌DNA激活后有

8、表達(dá)增加，氯喹可抑制TLR9的表達(dá)。肺泡上皮細(xì)胞A549經(jīng)活性NTHi及細(xì)菌DNA刺激不表達(dá)TLR9蛋白，Westernblot檢測(cè)，ALIM肺組織經(jīng)活性NTHi、細(xì)菌DNA及合成的ODNM362刺激后的TLR9有上調(diào)，MAPKp38p及ERKp44/42信號(hào)通路參與了活性NTH刺激后的TLR9蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.NTHi不但能進(jìn)入胞內(nèi)，且在胞內(nèi)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)；細(xì)胞內(nèi)NTHi刺激細(xì)胞表達(dá)炎癥介質(zhì)的水平大概

9、相當(dāng)于NTHi刺激細(xì)胞總炎癥介質(zhì)水平的10%至30%。NTHi與呼吸道之間相互作用，NTHi可侵入并存留在上皮細(xì)胞及單核細(xì)胞內(nèi)，刺激細(xì)胞釋放炎癥因子，保持呼吸道處于慢性炎癥狀態(tài)，NTHi的這種作用是COPD急性加重及慢性炎癥的基礎(chǔ)。
　　 2.滅活的NTHi同活性細(xì)菌一樣，可產(chǎn)生較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，而NTHiDNA和合成的ODNM362具有弱免疫活性。
　　 3.外周血單核細(xì)胞及肺組織均表達(dá)TLR9mRNA及TLR9蛋白，但