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文檔簡介
1、本文主要就以下幾部分展開: 目的:通過不可分型流感嗜血桿菌與單核細胞相互作用,研究絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號傳導(dǎo)通路在不可分型流感嗜血桿菌(nontypeable haemophilus influenza,NTHI)致人體免疫細胞炎癥反應(yīng)的作用。方法:NTHI為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院臨床分離株,經(jīng)血清學(xué)和16sRNA測序證實,外周血單核細胞分離自健
2、康成年人的靜脈血。NTHI與單核細胞共培養(yǎng),1h、4h后收集細胞用Western Blot檢測p38、p44/42-MAPK的磷酸化;16h后用流式細胞儀檢測細胞表面TLR4的表達。預(yù)先用p38-MAPK抑制劑(SB203580)和p44/42-MAPK抑制劑(UO126)與單核細胞共孵育1h,然后加入NTHI(感染復(fù)數(shù):200),分別在4h、16h后收集上清,以酶聯(lián)免疫吸附法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平。結(jié)果:NTHI能迅速
3、地誘導(dǎo)p38,p44/42-MAPK通路的磷酸化,并至少持續(xù)到刺激后4h。與未加細菌組比較,NTHI刺激16h后單核細胞表面TLR4受體表達明顯增加,上清中TNF-α增加(p<0.05)。與細菌攻擊組比較,阻斷p38-MAPK,而不是阻斷p44/42-MAPK通路,能顯著地降低單核細胞分泌。TNF-α(p<0.05)。結(jié)論:TLR4可能參與了NTHI致單核細胞炎癥反應(yīng);p38-MAPK是NTHI誘導(dǎo)單核細胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號分子。
4、 第二部分: 目的:通過建立呼吸道上皮細胞株的體外NTHI感染模型,確認NTHI在細胞內(nèi)的存活,觀察NTHI及其組分(可溶性胞質(zhì)成分SCF、外膜蛋白EP)對呼吸道上皮細胞MAPK信號傳導(dǎo)通路和后續(xù)的前炎癥因子表達的影響,并應(yīng)用特異性ERK—MAPK抑制劑U0126、p38 MAPK抑制劑SB203580特異性阻斷下游MAPK信號傳導(dǎo)通路,觀察它們對呼吸道上皮細胞分泌前炎癥因子表達的影響。方法:NTHI系臨床分離株,經(jīng)常規(guī)和基因
5、測序鑒定。NTHI與氣道上皮細胞共培養(yǎng),透射電鏡觀察A549細胞內(nèi)定植,12h后Triton破膜,再行培養(yǎng)證實細菌存活;westernblot檢測A549及BEAS-2B細胞p—p38和p-ERK MAPK蛋白的表達;超聲打碎細胞,超速離心分離NTHI可溶性胞質(zhì)成分和外膜蛋白,流式細胞儀測定A549細胞NF-kBPp65的表達;ELISA測定A549和BEAS-2B細胞IL-8的表達。結(jié)果:NTHi在感染A549細胞4h后即有大量NTH
6、I進入胞內(nèi),且細胞內(nèi)的NTHI數(shù)目與感染時間和細菌數(shù)目成正比;用Triton X-100破膜,對胞內(nèi)細菌行體外培養(yǎng),在巧克力平板上過夜后即見NTHI生長。Western blot顯示:NTHI刺激15rain-30min后,A549細胞內(nèi)的p-p38和p-ERKMAPK表達開始增加;NTHI刺激15min-30min后,BEAS-2B細胞內(nèi)的p-p38、p-ERKMAPK表達開始增加。流式細胞法顯示:NTHI和SCF、EP刺激4h后,A
7、549細胞內(nèi)NF—rB p65的表達較培養(yǎng)基組明顯增強:與培養(yǎng)基對照比較,NTHI、SCF、EP組均明顯增強,其中完整NTHI作用最強。A549在NTHI刺激后IL-8分泌增加,可被SB203580抑制,但不被U0126抑制。BEAS-2B細胞在NTHI刺激后IL-8分泌增加,可部分被兩種MAPK抑制劑所抑制。結(jié)論:NTHI可以進入A549細胞并存活,是兼性的胞內(nèi)菌:NTHI及其菌體成分對肺上皮細胞均有較強的致炎作用,完整細菌的作用最強
8、:p38MAPK、ERK MAPK和NF-KB均參與NTHI致氣道上皮炎癥反應(yīng),但MAPK參與NTHI致肺泡上皮細胞和支氣管上皮細胞的炎癥反應(yīng)時的通路有所不同,p38可能是主要的信號傳導(dǎo)通路。 第三部分: 目的:通過建NTHI感染氣道上皮細胞的體外模型和小鼠的感染模型,研究NTHI誘導(dǎo)氣道上皮細胞和肺組織COX2和PGE2的表達,揭示Toll樣受體在NTHI致氣道上皮細胞和肺組織炎癥反應(yīng)中的作用,同時闡明p38MAPK和
9、NF-kB兩條信號傳導(dǎo)通路的作用及兩者之間的關(guān)系。方法:用不同濃度的NTHI感染A549細胞以建立細胞體外感染模型。Western Not:檢測p38MAPK的磷酸化,電泳遷移率試驗測定NF-κB DNA結(jié)合活力,COX-1、COX-2 mRNA和PGE2蛋白的表達分別采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗。用高表達TLR2和TLR4的HEK293細胞試驗以及用TLR2、TLR4基因敲除小鼠體內(nèi)試驗,研究TLR2、TLR4在COX-2
10、表達中的作用。另外,用特異性分子抑制劑阻斷p38MAPK和NF-κB來揭示兩條信號傳導(dǎo)通路的作用。結(jié)果:在A549細胞NTHI誘導(dǎo)COX-2mRNA表達呈劑量相關(guān)性,但不影響COX-1 mRNA的表達。NTHI感染引起的PGE2表達增高可以被特異性的COX-2抑制劑所抑制,但不被COX-1抑制劑所抑制。NTHI誘導(dǎo)的COX-2表達在上皮細胞的體外試驗和肺組織的體內(nèi)試驗中都是通過TLR2介導(dǎo)的。NTHI可以誘導(dǎo)p38 MAPK磷酸化和NF
11、-kB DNA結(jié)合活力的上調(diào),COX-2和后續(xù)PGE2可以被p38 MAPK及NF-kB特異性抑制劑所阻斷;但是NTHI誘導(dǎo)的NF-κB DNA結(jié)合活力的上調(diào)不受p38 MAPK抑制劑的影響。結(jié)論:NTHI感染氣道上皮細胞是通過COX-2而非COX-1引起PGE2表達增高;無論是體外還是體內(nèi),TLR2是介導(dǎo)NTHI誘導(dǎo)COX-2和PGE2表達的主要表面受體;NTHI誘導(dǎo)COX-2和PGE2表達是通過p38MAPK及NF-κB兩條信號傳導(dǎo)
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