氨溴索對(duì)流感嗜血桿菌生物膜的作用研究.pdf

1、細(xì)菌生物膜（Biofilm，BF）最早由1987年美國(guó)Costerton教授提出，是細(xì)菌在某些惰性實(shí)體表面形成的多細(xì)胞復(fù)合體的生存方式,是具有一定空間構(gòu)型的細(xì)菌群體,由被覆細(xì)菌、細(xì)菌脂多糖、纖維蛋白、DNA、RNA等成分組成。學(xué)者普遍認(rèn)為，超過80％的臨床感染和BF有關(guān)。流感嗜血桿菌是一種革蘭陰性桿菌，寄生在人上呼吸道，在人體免疫力低下時(shí)，引起感染。研究顯示，流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）BF和多種疾病有關(guān)

2、，如：慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化、慢性鼻-鼻竇炎、分泌性中耳炎、兒童腺樣體肥大等。BF形成后，細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性可增強(qiáng)10-1000倍。氨溴索（ambroxol，AMB）是一種常用的祛痰劑，臨床常用于呼吸道痰液的稀釋，改善通氣狀況；近年研究發(fā)現(xiàn)，AMB對(duì)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等細(xì)菌BF具有清除和殺菌作用，但AMB是否對(duì)流感嗜血桿菌BF具有

3、相同的作用，還未見報(bào)道。本課題從腺樣體肥大患兒離體腺樣體組織分離流感嗜血桿菌，體外培養(yǎng)BF，測(cè)定各臨床株的成膜能力，測(cè)定流感嗜血桿菌成膜前后對(duì)常用抗生素敏感性變化；然后從各流感嗜血桿菌臨床株中選取成膜能力最強(qiáng)的2株細(xì)菌，觀察AMB對(duì)流感嗜血桿菌BF清除作用以及對(duì)生物膜菌的殺菌作用，最后觀察AMB聯(lián)合抗生素對(duì)生物膜菌的殺菌作用。
　　首先收集腺樣體肥大患兒術(shù)中離體腺樣體標(biāo)本，經(jīng)過分離、培養(yǎng)和鑒定，將鑒定的流感嗜血桿菌菌株保存。96孔

4、板結(jié)晶紫染色測(cè)定各臨床分離株形成BF能力；培養(yǎng)BF形成后，掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察 BF結(jié)構(gòu)，并比較 BF形成前后對(duì)氨芐西林（ampicillin, AMPC）、頭孢曲松（ceftriaxone,CRO）、左氧沙星（levofloxacin,LVFX）、阿奇霉素（azithromycin,AZM）4種類別抗生素敏感性變化；從流感嗜血桿菌臨床株中選取2株成膜能力最強(qiáng)的流感嗜血桿菌菌株

5、，結(jié)晶紫染色法觀察AMB對(duì)2株流感嗜血桿菌BF的清除作用，菌落計(jì)數(shù)法觀察AMB對(duì)其生物膜菌殺菌作用，最后用二苯基四氮唑溴鹽（MTT）減低法檢測(cè)AMB和AMPC聯(lián)合應(yīng)用對(duì)其生物膜菌殺菌作用。
　　共收集36份離體腺樣體組織，經(jīng)分離、培養(yǎng)、鑒定共獲得30株流感嗜血桿菌，體外培養(yǎng)72h發(fā)現(xiàn)30株流感嗜血桿菌均能形成BF，但成膜能力大小不一,HI12和HI23成膜最強(qiáng)。經(jīng)SEM觀察，流感嗜血桿菌BF菌體清晰,結(jié)構(gòu)明顯。相對(duì)浮游菌，BF形成

6、后，生物膜菌對(duì)AMPC，CRO，LVFX，AZM敏感性降低，AMPC的最低生物膜清除濃度（minimal biofilm eradication concentration，MBEC）值最高，最高可達(dá)其最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）值100倍之多；CRO的MBEC值是其MIC和MBC值的

7、十幾倍到數(shù)十倍；LVFX的MBEC值是其MIC、MBC值的幾倍大??；AZM的MBEC值最接近于其MBC和MIC值。結(jié)晶紫法示，AMB對(duì)流感嗜血桿菌BF具有清除作用，當(dāng)AMB分別達(dá)到0.24mg?ml-1和0.47 mg? ml-1時(shí)，分別對(duì)2株細(xì)菌HI23和HI12 BF具有清除作用（P?0.05)，SEM發(fā)現(xiàn)，AMB處理后BF結(jié)構(gòu)變薄，密度減小。菌落計(jì)數(shù)示，AMB具有殺菌作用，該殺菌作用呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示，AMB聯(lián)合AMPC