氨溴索聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌生物膜的殺滅作用及調(diào)控系統(tǒng)影響.pdf

1、第一部分、氨溴索聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌生物被膜的殺菌作用
　　目的；建立聚乙烯材料表面表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）生物被膜（biofilm，BF）的體外模型，研究氨溴索聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌RP62A菌株生物被膜的殺菌作用。
　　方法：在無菌聚乙烯片表面建立表皮葡萄球菌RP62A菌株的成熟BF模型，運(yùn)用快速銀染法觀察和鑒定成熟BF的結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)組，空白對照組，萬古霉素(1M

2、IC)組，氨溴索(1.875mg/l)組，萬古霉素(1MIC)+氨溴索（1.875mg/l）組，空白對照組僅加TSB培養(yǎng)基，萬古霉素，氨溴索作用24小時(shí)。分組干預(yù)后，利用二甲氧唑黃(XTT)比色法檢測生物被膜內(nèi)的活菌數(shù)量，結(jié)合多功能酶標(biāo)儀測定吸光值，定量分析比較各個(gè)干預(yù)組中BF內(nèi)的細(xì)菌活力。
　　結(jié)果：經(jīng)過24小時(shí)的連續(xù)培養(yǎng)后表皮葡萄球菌RP62A菌株形成成熟BF。經(jīng)銀染后，倒置顯微鏡下可見膜表面呈灰黑色著色，視野內(nèi)有大量成團(tuán)聚集

3、的管狀、團(tuán)塊狀物質(zhì)，即認(rèn)為是被染色的BF。XTT法測BF中細(xì)菌活力結(jié)果顯示空白對照組、萬古霉素組、氨溴索組、氨溴索+萬古霉素組OD450值分別為2.867±0.425，2.869±0.325，1.812±0.210，0.875±0.191;萬古霉素組與空白組相比，P＞0.05;氨溴索組、氨溴索組+萬古霉素與空白對照組相比，P＜0.05;氨溴索組+萬古霉素與氨溴索組相比，P＜0.05。
　　結(jié)論：單獨(dú)萬古霉素對成熟的表皮葡萄球菌BF

4、內(nèi)細(xì)菌無殺滅效果，1.875mg/l濃度的氨溴索對表皮葡萄球菌BF有一定的殺滅效果，當(dāng)萬古霉素與氨溴索聯(lián)合使用時(shí)，能明顯殺滅表皮葡萄球菌BF內(nèi)的細(xì)菌，表明氨溴索與萬古霉素有協(xié)同清除作用。
　　第二部分、氨溴索聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌生物被膜結(jié)構(gòu)的影響
　　目的：探討氨溴索聯(lián)合萬古霉素干預(yù)表皮葡萄球菌BF結(jié)構(gòu)的影響，驗(yàn)證兩者聯(lián)合運(yùn)用可以起到協(xié)同清除作用。
　　方法：在無菌聚乙烯片表面建立表皮葡萄球菌RP62A菌株的成熟

5、BF模型，分為4個(gè)組，空白對照組，萬古霉素(1MIC)組，氨溴索（1.875mg/l）組，萬古霉素(1MIC)+氨溴索(1.875mg/l)組;用熒光染料SYTO9/PI對BF內(nèi)的細(xì)菌染色后，置于激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)觀察，利用圖像結(jié)構(gòu)分析(image structure analyer，ISA)軟件對各不同干預(yù)組BF結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析。
　　結(jié)果；單用萬古

6、霉素時(shí)，CLSM圖片活菌（綠色熒光）占多數(shù)，死菌（紅色熒光）較少，結(jié)構(gòu)變化不大，與對照組無明顯差異;氨溴索組可見死菌（紅色信號）增多，結(jié)構(gòu)變稀疏。氨溴索聯(lián)合萬古霉素作用，與單獨(dú)用藥組相比BF的厚度進(jìn)一步減小，活菌減少，死菌比例增加，僅剩小的細(xì)菌團(tuán)塊。ISA分析數(shù)據(jù)顯示，萬古霉素組與空白對照組相比，區(qū)域孔率（Areal Porosity, AP）、平均擴(kuò)散距離(Average DiffusionDistance，ADD)、結(jié)構(gòu)熵(text

7、ual entropy，TE)無顯著差異，氨溴索組，萬古霉素+氨溴索組與空白對照組相比BF厚度、ADD、TE、降低(P＜0.05)，AP增加(P＜0.05);且氨溴索組+萬古霉素與氨溴索組相比作用效果更明顯。
　　結(jié)論：單獨(dú)萬古霉素?zé)o法破壞對成熟的表皮葡萄球菌BF結(jié)構(gòu)，氨溴索對表皮葡萄球菌BF結(jié)構(gòu)有一定的破壞，氨溴索與萬古霉素存在協(xié)同作用，兩者聯(lián)用可使表皮葡萄球菌BF的結(jié)構(gòu)變得簡單稀疏，對BF內(nèi)細(xì)菌有明顯的殺滅作用。
　　第

8、三部分、氨溴索聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌生物被膜調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因的影響
　　目的：探討氨溴索聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌BF調(diào)控系統(tǒng)中agr，icaR和icaA基因表達(dá)的影響。
　　方法：建立表皮葡萄球菌RP62A菌株的成熟BF模型，分為4個(gè)組，空白對照組，萬古霉素(1MIC)組，氨溴索（1.875mg/l）組，萬古霉素(1MIC)+氨溴索（1.875mg/l）組;作用24小時(shí)后，應(yīng)用RT-PCR檢測不同干預(yù)組的表皮葡萄球菌B

9、F調(diào)控系統(tǒng)中agr，icaR和icaA基因表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：通過RT-PCR檢測，萬古霉素(1MIC)與空白對照組相比，agr，icaR、icaA基因表達(dá)均無明顯差異(P＞0.05)。萬古霉素+氨溴索組agr、icaR基因相對于空白對照組表達(dá)量均有增加，agr由0.268±0.082變?yōu)?.507±0.131(p＜0.05)，icaR由0.358±0.085變?yōu)?.892±0.146。單獨(dú)氨溴索組具有同樣趨勢，但效果不如萬