萬(wàn)古霉素敏感性下降金黃色葡萄球菌的耐藥機(jī)制研究及萬(wàn)古霉素聯(lián)合治療方案探索.pdf

1、目的:
　　萬(wàn)古霉素敏感性下降金黃色葡萄球菌包括萬(wàn)古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌(Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus，VISA)、異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌(Heterogeneous Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus，hVISA)以及耐受性菌株。這些菌株往往與萬(wàn)古霉素(Vancomycin，VAN)治療效果不

2、佳有關(guān)，同時(shí)對(duì)二次治療更加耐藥。VAN治療失敗的問(wèn)題備受臨床關(guān)注，積極探索防止這類(lèi)菌株出現(xiàn)及傳播的策略、明確其分子生物學(xué)耐藥機(jī)制以及尋找有效的治療方案十分必要。
　　方法:
　　選取Mu3(VAN MIC=2mg/L)作為研究菌株，將其暴露在不同的抗菌藥物環(huán)境中，進(jìn)行為期28天的體外誘導(dǎo)耐藥。抗菌藥物暴露方案為VAN單藥，VAN聯(lián)合頭孢唑啉(Cefazolin，CFZ)、磷霉素(Fosfomycin，F(xiàn)OF)、慶大霉素(Ge

3、ntamicin，GEN)、美羅培南(Meropenem，MEM)、利福平(Rifampin，RIF)、哌拉西林他唑巴坦(Piperacillin-Tazobactam，TZP)以及磺胺甲惡唑/甲氧芐啶(Trimethoprim-Sulfamethoxazole，SXT)。對(duì)Mu3和經(jīng)體外誘導(dǎo)出的菌株進(jìn)行抗菌藥物敏感性測(cè)定，并檢測(cè)細(xì)胞壁厚度、類(lèi)胡蘿卜素含量及膜流動(dòng)性。然后對(duì)Mu3及所有誘導(dǎo)出的菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序?；蚪MDNA的提取由J

4、ANUS自動(dòng)化工作站完成。DNA文庫(kù)的制備應(yīng)用NextEra XTDNA提取試劑盒制備。全基因組測(cè)序在NexSeg儀器進(jìn)行，測(cè)長(zhǎng)2*150bp。最后通過(guò)體外藥代動(dòng)力學(xué)/藥效動(dòng)力學(xué)(Pharmacokinetic/Pharmacodynamics，PK/PD)模型實(shí)驗(yàn)，通過(guò)高精度色譜泵模擬不同藥物的半衰期，運(yùn)行48小時(shí)，評(píng)價(jià)VAN聯(lián)合待測(cè)3種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物對(duì)hVISA菌株——Mu3的體外抗菌活性，并設(shè)定β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的給藥頻次

5、為每24小時(shí)一次，每12小時(shí)一次和每8小時(shí)一次，以觀察不同的給藥頻次在與VAN聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的殺菌作用。分別在第0、1、2、4、6、8、12、24、26、28、32和48h從模型中采樣進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，繪制時(shí)間殺菌曲線，通過(guò)計(jì)算時(shí)間殺菌曲線下面積(Area Under the Curve，AUC)來(lái)比較抗菌藥物的殺菌作用。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)過(guò)28天的體外抗菌藥物暴露，VAN聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物僅使VAN MIC上升至2-4mg

6、/L，其中VAN+CFZ和VAN+TZP聯(lián)合用藥組最為有效，VAN MIC僅為2mg/L。Mu3暴露于其他抗菌藥物組合，除了VAN+FOF，在第7天時(shí)均能阻止VAN MIC的上升，但是從第二周開(kāi)始就不再表現(xiàn)出抑制VAN MIC上升的作用，使VAN MIC上升至4-16mg/L。細(xì)胞壁厚度與VAN MIC呈正相關(guān)(R2=0.939)。對(duì)比經(jīng)VAN單藥誘導(dǎo)出的菌株，經(jīng)VAN+β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物誘導(dǎo)出的菌株的細(xì)胞壁厚度明顯減小，而經(jīng)VAN聯(lián)

7、合非β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物誘導(dǎo)出的菌株細(xì)胞壁厚度明顯增厚。類(lèi)胡蘿卜素含量(R2=0.267)和膜流動(dòng)性(R2=0.680)與VAN MIC之間無(wú)相關(guān)性。
　　對(duì)全部25株菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序共檢測(cè)到60個(gè)獨(dú)立的變異位點(diǎn)，包括51個(gè)單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，3個(gè)基因插入和6個(gè)基因缺失。經(jīng)VAN+CFZ誘導(dǎo)耐藥的菌株與母代菌株Mu3比對(duì)無(wú)任何基因突變發(fā)生。只有經(jīng)VAN+RIF

8、誘導(dǎo)耐藥的菌株發(fā)生了rpoB突變(3/24)，為A471G和H481N。pbp2突變?nèi)勘憩F(xiàn)在經(jīng)VAN+MEM誘導(dǎo)出的菌株中(3/24)(S499Y，P505T，G631R，G631V)，而mecA突變G487D，G574D均由VAN+TZP誘導(dǎo)出(3/24)。rpoC突變(7/24)在經(jīng)VAN單藥(3/3，L1150H)、VAN+SXT聯(lián)合暴露(3/3，L1150H，D1160V和R967G)和VAN+MEM聯(lián)合暴露(1/3，V669

9、L)誘導(dǎo)的菌株中均有發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)為多態(tài)性。walR突變僅由VAN+FOF(1/24)誘導(dǎo)產(chǎn)生的;walK突變發(fā)生在經(jīng)VAN+GEN(2/3)、VAN+SXT(1/3)和VAN+RIF(1/3)誘導(dǎo)的菌株中，也表現(xiàn)出多態(tài)性(S584I，A243T，I183K，V383I)。4/24的菌株檢測(cè)出vraG突變，分別為分布在經(jīng)VAN+GEN(1/3)、VAN+SXT(2/3)和VAN+FOF(1/3)誘導(dǎo)的菌株中，也表現(xiàn)為多態(tài)性。僅有2/24菌株

10、被誘導(dǎo)出mprF突變(S295L，S337T)，分別由VAN+RIF和VAN+FOF誘導(dǎo)出。
　　在體外PK/PD模型實(shí)驗(yàn)中，VAN單藥組在24小時(shí)時(shí)表現(xiàn)出了對(duì)Mu3的殺菌活性，但是從32小時(shí)到48小時(shí)出現(xiàn)了細(xì)菌再生長(zhǎng)，所有的待測(cè)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物對(duì)Mu3均未顯示出殺菌活性。在聯(lián)合用藥模型中，除了VAN+CFZ組在12小時(shí)時(shí)顯示了對(duì)Mu3的殺菌活性，VAN+MEM組和VAN+TZP組均在8小時(shí)時(shí)表現(xiàn)出了對(duì)Mu3的殺菌活性。對(duì)比V

11、AN單藥組，在所有的VAN+β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的聯(lián)合用藥方案中，無(wú)論何種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物，無(wú)論β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的給藥頻次如何均未見(jiàn)細(xì)菌再生長(zhǎng)。對(duì)比VAN單藥組，VAN+β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物聯(lián)合用藥方案在達(dá)到殺菌活性的時(shí)間(P＜0.005)和AUC(P＜0.001)兩方面均表現(xiàn)出更強(qiáng)的殺菌活性，具有顯著差異。在所有聯(lián)合用藥方案中，VAN+MEM組和VAN+TZP組的AUC明顯小于VAN+CFZ組(P＜0.01)。在所有的VAN聯(lián)

12、合β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的方案中，變換β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的給藥頻次，對(duì)Mu3的殺菌活性無(wú)論是在達(dá)到殺菌作用的時(shí)間還是AUC均沒(méi)有明顯差異。
　　結(jié)論:
　　該研究清楚地表明，在體外VAN聯(lián)合治療能顯著地影響hVISA向VISA轉(zhuǎn)變。但只有VAN聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物有效的抑制了VAN耐藥的發(fā)展。鑒于VAN聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物具有抑制VAN耐藥的作用，該聯(lián)合用藥方案作為治療嚴(yán)重MRSA感染的長(zhǎng)期治療方案還應(yīng)做進(jìn)一步的探討

13、。VAN單藥及VAN+GEN、VAN+SXT、VAN+RIF和VAN+FOF在體外誘導(dǎo)出的菌株雖都為VISA表型，但決定其表型的基因通路卻各有差異。VAN+CFZ聯(lián)合用藥抑制了VISA表型發(fā)展的基因通路，阻止了hVISA向VISA轉(zhuǎn)變。在體外PK/PD模型中，VAN聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物顯示出了協(xié)同作用。在與VAN聯(lián)合用藥時(shí)，同種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物不同的給藥頻次之間對(duì)Mu3的殺菌作用無(wú)明顯差異。故在VAN與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物聯(lián)合用