體外萬(wàn)古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌演變過(guò)程及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-ResistantStaphylococcus Aureus，MRSA)自1961年被發(fā)現(xiàn)后，到80年代后期就已成為全球發(fā)生率最高的醫(yī)院內(nèi)感染病原菌之一。萬(wàn)古霉素一直作為治療MRSA感染的一線用藥，但近年來(lái)萬(wàn)古霉素治療失敗的病例日益增多，導(dǎo)致MRSA治療成為臨床關(guān)注的熱點(diǎn)，國(guó)外部分地區(qū)已出現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌(Vancomycin-resistant Staphyloc

2、occusaureus)和萬(wàn)古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌(Vancomycinintermediate-resistant staphylococcus aureus，VISA)，本課題組前期研究表明我國(guó)南方地區(qū)MRSA對(duì)萬(wàn)古霉素的MIC有逐年上升的趨勢(shì)，深入了解MRSA對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥機(jī)制，有助于提高我們對(duì)MRSA耐藥性的認(rèn)識(shí)。
　　本研究通過(guò)體外誘導(dǎo)萬(wàn)古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌，從遺傳背景和耐藥基因突變方面對(duì)萬(wàn)古霉素中介耐藥金

3、黃色葡萄球菌進(jìn)行研究，旨在探討萬(wàn)古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌的發(fā)生機(jī)制。
　　本研究分為兩部分，第一部分實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)萬(wàn)古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌的表型特征和遺傳背景變化;基于第一部分研究的發(fā)現(xiàn):一株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌演變?yōu)槿f(wàn)古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌過(guò)程中丟失了mecA基因，也就是苯唑西林的耐藥性，則第二部分對(duì)萬(wàn)古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌mecA基因丟失的分子機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法:通過(guò)低濃度萬(wàn)古霉素逐步誘導(dǎo)臨床

4、MRSA菌株，MIC檢測(cè)菌株對(duì)萬(wàn)古霉素和苯唑西林的耐藥性，PCR檢測(cè)菌株mecA基因，PFGE驗(yàn)證誘導(dǎo)株和親本株的同源性，MLST和SCCmec分型分析VISA的相關(guān)性。對(duì)實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的VISA和親本株VSSA進(jìn)行PCR檢測(cè)雙組份系統(tǒng)VraSR、GraRS、WalKR以及rpoB基因，測(cè)序分析有無(wú)氨基酸改變。通過(guò)PFGE方法對(duì)缺失mecA基因的VISA菌株和其VSSA菌株進(jìn)行分析，多位點(diǎn)PCR確定缺失片段的位置，PCR連接缺失位點(diǎn)兩端，測(cè)

5、序分析缺失位點(diǎn)周圍基因環(huán)境。
　　結(jié)果:通過(guò)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，14株臨床分離的MRSA中有12株達(dá)到VISA水平，其中2株ST239-SCCmecⅢ、2株ST5-SCCmecⅡ和1株新SCCmec型MRSA萬(wàn)古霉素MIC達(dá)到8-10ug/ml。脫離萬(wàn)古霉素后，10株菌對(duì)萬(wàn)古霉素的MIC都可回復(fù)至敏感限(≤2ug/ml)，有兩株菌(4126，3503)在連續(xù)傳代20天后對(duì)VAN的MIC仍未回復(fù)，PFGE證實(shí)這兩株菌為同一克隆，其中菌株350

6、3誘導(dǎo)后表現(xiàn)出對(duì)苯唑西林敏感，PCR證實(shí)mecA基因陰性，誘導(dǎo)成功的大部分VISA對(duì)苯唑西林的MIC下降。一株VISA的rpoB第862位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，未在VISA中發(fā)現(xiàn)VraSR、GraRS、WalKR雙組份調(diào)控系統(tǒng)的突變。菌株3503在誘導(dǎo)到萬(wàn)古霉素MIC等于6ug/ml時(shí)發(fā)生SCCmec(Staphylococcus cassettechromosome mec，SCCmec)基因島片段丟失，丟失片段為包含mecA基因的40

7、kb左右的SCCmec基因，當(dāng)其萬(wàn)古霉素MIC升高至10ug/ml時(shí)，又出現(xiàn)大約40kb的DNA丟失，兩次DNA片段丟失均位于轉(zhuǎn)座子IS131的下游。
　　結(jié)論:臨床分離的MRSA在體外較易誘導(dǎo)為VISA，大多數(shù)VISA不穩(wěn)定，可回復(fù)為VSSA。VISA產(chǎn)生萬(wàn)古霉素耐藥的同時(shí)可能伴隨苯唑西林敏感性增加，甚至因mecA基因丟失而恢復(fù)敏感?；騬poB突變可能參與VISA的形成。VISA的形成過(guò)程中可出現(xiàn)SCCmec基因島及其周圍的D