氨溴索對銅綠假單胞菌生物被膜密度感應(yīng)系統(tǒng)的影響.pdf

1、第一部分氨溴索對銅綠假單胞菌生長的影響。 [目的]研究氨溴索對銅綠假單胞生長的影響。 [方法]LB中培養(yǎng)銅綠假單胞菌PAO1，利用比濁法檢測濃度3.75 mg/mL和1.875 mg/mL的氨溴索作用后各組不同時間點(diǎn)菌液的光密度值A(chǔ)600，繪制生長曲線，比較各組細(xì)菌的生長曲線。 [結(jié)果]不同濃度氨溴索干預(yù)后，銅綠假單胞菌的生長曲線與培養(yǎng)基對照組相比無顯著差異。 [結(jié)論]氨溴索對銅綠假單胞菌的生長無顯著影響

2、。第二部分氨溴索對銅綠假單胞菌運(yùn)動及早期黏附的影響。 [目的]建立銅綠假單胞菌生物被膜（biofilm，BF）模型，研究氨溴索對銅綠假單胞菌運(yùn)動及早期黏附的影響。 [方法]應(yīng)用不同濃度的瓊脂平板接種PAO1菌株，培養(yǎng)后測量銅綠假單胞菌游動、叢集及顫觸運(yùn)動的范圍。在96孔板中培養(yǎng)pGFPuv轉(zhuǎn)化銅綠假單胞菌株P(guān)AO1菌株，不同濃度氨溴索干預(yù)后，利用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)菌的黏附量；利用熒光多功能酶標(biāo)儀檢測各組不同時間點(diǎn)的熒

3、光強(qiáng)度，比較各組細(xì)菌的黏附率。 [結(jié)果]氨溴索作用后，銅綠假單胞菌的各種運(yùn)動能力均出現(xiàn)不同程度的下降（p<0.05）。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)氨溴索干預(yù)組細(xì)菌的黏附量明顯比培養(yǎng)基對照組稀疏，以高濃度為甚。氨溴索作用后細(xì)菌的黏附率亦出現(xiàn)不同程度下降，其中高濃度更為顯著（p<0.05）。 [結(jié)論]氨溴索可降低銅綠假單胞菌的運(yùn)動能力和早期黏附，從而在BF形成的早期即可抑制BF的形成。 第三部分氨溴索對銅綠假單胞菌生物被膜密度

4、感應(yīng)系統(tǒng)信號分子及相關(guān)基因的影響。 [目的]探討氨溴索對銅綠假單胞菌BF密度感應(yīng)（Quorum-sensing，QS）系統(tǒng)信號分子-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserinelactone，AHL）的影響，以及對AHL合成酶編碼基因lasⅠ和rhlⅠ表達(dá)的影響。 [方法]通過平板培養(yǎng)法建立培養(yǎng)成熟的銅綠假單胞菌體外BF模型，用掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）鑒定生物被

5、膜的形成情況。不同濃度的氨溴索干預(yù)后，應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR（real-time PCR）檢測其對信號分子AHL合成酶編碼基因rhlⅠ和lasⅠ mRNA表達(dá)的影響；應(yīng)用AHL感應(yīng)菌株根癌土壤桿菌（WCF47）結(jié)合β-半乳糖苷酶活性的檢測氨溴索對QS系統(tǒng)信號分子AHL表達(dá)的影響。 [結(jié)果]平板法培養(yǎng)成熟生物被膜后，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測，氨溴索3.75 mg/mL作用組基因lasⅠ和rhlⅠ mRNA表達(dá)量相對于培養(yǎng)基對照組

6、各基因的表達(dá)量均有顯著減少，基因的相對表達(dá)量F值由1.000分別變化為3.548±0.070，1.914±0.050（p<0.05）。氨溴索1.875mg/mL干預(yù)后具有同樣趨勢，但效應(yīng)不如高濃度明顯（P<0.05）。氨溴索和1.875 mg/mL和3.75 mg/mL作用后信號分子AHL的表達(dá)量較培養(yǎng)基對照組有明顯減少，β-半乳糖苷酶活性從培養(yǎng)基對照組的761.286±13.301 Miller單位分別降低到645.428±15.19

7、7 Miller單位（p<0.05）和532.428±8.867 Miller單位（p<0.05）。 [結(jié)論]氨溴索可以通過下調(diào)QS系統(tǒng)中信號分子AHL合成酶編碼基因rhlⅠ和lasⅠ以及信號分子AHL的表達(dá)來抑制BF。 第四部分氨溴索對銅綠假單胞菌生物被膜密度感應(yīng)系統(tǒng)毒力因子及相關(guān)基因的影響。 [目的]探討氨溴索對銅綠假單胞菌BF QS系統(tǒng)所調(diào)控的毒力因子編碼基因以及各自對應(yīng)的毒力因子表達(dá)的影響。 [方

8、法]通過平板培養(yǎng)法培養(yǎng)建立成熟的銅綠假單胞菌BF體外模型。采用不同濃度氨溴索作用后，應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR檢測其對QS系統(tǒng)毒力因子編碼基因toxA，lasB，rhlA，aprA mRNA表達(dá)的影響。不同濃度氨溴索作用后，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測外毒素A和彈性蛋白酶的水平；地衣酚-硫酸法檢測鼠李糖脂水平；Folin-酚比色法檢測堿性蛋白酶活性；利用氯仿提取等來檢測綠膿菌素的水平，比較各組干預(yù)前后的檢測結(jié)果。 [結(jié)果]

9、通過實(shí)時熒光定量PCR檢測，氨溴索3.75 mg/mL作用后基因toxA，rhlA，lasB，aprA mRNA相對于培養(yǎng)基對照組的表達(dá)量均有顯著減少，由1.000分別變化為3.033±0.083，2.702±0.086，2.095±0.095，2.196±0.097（p<0.05）。氨溴索3.75 mg/mL作用后毒力因子外毒素A、彈性蛋白酶、鼠李糖脂、堿性蛋白酶、綠膿菌素的表達(dá)量較培養(yǎng)基對照組有明顯減少，分別由15.220±0.98

10、9 mg/L，81.384±5.440 ng/L，289.725±6.719 mg/L，300.588±6.526 U/L，32.746±1.649 mg/L變化到3.482±0.600 mg/L，29.755±3.843 ng/L，101.741±3.315 mg/L，105.375±3.432 U/L，13.876±1.055 mg/L（p<0.05）。氨溴索1.875 mg/mL干預(yù)后具有同樣趨勢，但效應(yīng)不如高濃度明顯（P<0.0

11、5）。 [結(jié)論]氨溴索可以降低銅綠假單胞菌生物被膜QS系統(tǒng)調(diào)控的毒力因子相關(guān)基因toxA，lasB，rhlA，aprA以及毒力因子外毒素A、彈性蛋白酶、鼠李糖脂、堿性蛋白酶、綠膿菌素的表達(dá)。 第五部分氨溴索對銅綠假單胞菌生物被膜密度感應(yīng)系統(tǒng)的體內(nèi)干預(yù)作用。 [目的]建立大鼠導(dǎo)管相關(guān)性銅綠假單胞菌生物被膜感染模型，探討氨溴索對銅綠假單胞菌生物被膜密度感應(yīng)系統(tǒng)的體內(nèi)干預(yù)作用。 [方法]建立銅綠假單胞菌臨床分離

12、株BF體外模型，培養(yǎng)7天后得到成熟BF。將BF植入大鼠氣管建立大鼠導(dǎo)管相關(guān)性銅綠假單胞菌生物被膜感染模型，分為BF感染組，氨溴索干預(yù)組，空白導(dǎo)管對照組。分別在BF導(dǎo)管植入后第4天和第7天用熒光定量PCR檢測導(dǎo)管上信號分子合成編碼基因lasⅠ和rhlⅠ，應(yīng)用AHL感應(yīng)菌株根癌土壤桿菌WCF47結(jié)合β-半乳糖苷酶活性的檢測信號分子AHL的含量。將肺組織進(jìn)行HE染色后，顯微鏡下觀察肺組織的病理改變。按前述方法，分別檢測各組大鼠肺組織勻漿中外毒

13、素A、彈性蛋白酶、鼠李糖脂、堿性蛋白酶的含量。 [結(jié)果]成功建立大鼠導(dǎo)管相關(guān)性銅綠假單胞菌生物被膜感染模型。氨溴索干預(yù)后4天和7天BF感染組與氨溴索干預(yù)組AHL編碼基因lasⅠ的相對表達(dá)量F值為1.000 VS2.487±0.207（p<0.05）和1.000 VS3.221±0.211（p<0.05）；氨溴索干預(yù)后4天和7天基因rhlⅠ BF感染組與氨溴索干預(yù)組的相對表達(dá)量F值為1.000 VS1.591±0.197（p<0.

14、05）和1.000 VS1.983±0.175（p<0.05）。氨溴索作用4天和7天后信號分子AHL相對含量--β-半乳糖苷酶活性分別由BF感染組的563.875±25.991和641.375±19.398變化為420.250±26.391和356.001±32.351（Miller單位，p<0.05）。氨溴索干預(yù)4天和7天后，顯微鏡下各組肺組織的病理變化有顯著差異。氨溴索干預(yù)組肺組織勻漿中各毒力因子的水平較BF感染組亦出現(xiàn)不同程度下降