無莢膜流感嗜血桿菌DNA通過STING信號(hào)通路誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的初步研究.pdf

1、目的：
　　探究無莢膜流感嗜血桿菌DNA(NTHI-DNA)在NTHI誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中的作用，并對(duì)其應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行研究。
　　背景：
　　無莢膜流感嗜血桿菌(NTHI)是一種常見的革蘭陰性菌，正常情況下，作為條件致病菌定植于上呼吸道，但當(dāng)免疫力低下時(shí)可以移行至下呼吸道，誘發(fā)感染性疾病。一直以來，NTHI作為胞外菌被人們所熟知；但現(xiàn)有研究證實(shí)，NTHI也可以內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞。內(nèi)化的細(xì)菌可以躲避高濃度的抗生素，這是中耳炎和慢性阻塞

2、性肺疾病(COPD)加重的重要原因。在肺炎鏈球菌、李斯特菌、結(jié)核分枝桿菌等多個(gè)感染模型中已證實(shí)細(xì)菌DNA可以被胞內(nèi)DNA識(shí)別受體所識(shí)別進(jìn)而誘導(dǎo)一系列信號(hào)通路開放，其中干擾素刺激基因(STING)介導(dǎo)的I型干擾素(I-IFN)產(chǎn)生是DNA免疫中最典型的信號(hào)通路。目前尚未有NTHI-DNA可以誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的報(bào)道。因此，本研究我們將對(duì)NTHI-DNA通過STING信號(hào)通路誘導(dǎo)I-IFN產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行探究。
　　主要研究方法：

3、　　1.采用抗生素保護(hù)實(shí)驗(yàn)(APA)檢測(cè)NTHI感染后，IFN-β和CXCL10的表達(dá)，了解內(nèi)化NTHI誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力；提取NTHI-DNA分別刺激上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并檢測(cè)I-IFN和CXCL10的表達(dá)，初步證實(shí)NTHI-DNA作為免疫刺激物可誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答。
　　2.初步檢測(cè)NTHI感染后細(xì)胞中幾種常見DNA識(shí)別受體的表達(dá)；干擾RNA(siRNA)特異性敲低MEF細(xì)胞中cGAS的表達(dá)，檢測(cè)cGAS對(duì)內(nèi)化NTHI及NTHI

4、-DNA誘導(dǎo)I-IFN及CXCL10的影響。
　　3.分別比較NTHI-DNA刺激下，STING野生細(xì)胞(MEFWT)與STING缺陷細(xì)胞(MEFSTING-/-)以及HEK293T細(xì)胞中空載組與過表達(dá)STING組誘導(dǎo)IFN-β及CXCL10的差異，證實(shí)STING在NTHI-DNA介導(dǎo)免疫應(yīng)答中的作用。比較NTHI-DNA刺激后，HEK293T細(xì)胞中空載組、過表達(dá)TBK1組、過表達(dá)TBK1(ΔULD)組誘導(dǎo)IFN-β及CXCL10

5、的差異，明確TBK1在NTHI-DNA誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中扮演的角色。NTHI-DNA刺激下，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)p-IRF3的表達(dá)；比較HEK293T細(xì)胞中空載組與過表達(dá)IRF3組誘導(dǎo)IFN-β及CXCL10的差異，了解IRF3對(duì)NTHI-DNA誘導(dǎo)免疫答的影響。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.內(nèi)化NTHI及NTHI-DNA均可誘導(dǎo)I-IFN及CXCL10表達(dá)上調(diào)，且在RAW264.7細(xì)胞中觀察到，NTHI-DNA誘導(dǎo)I-

6、IFN及CXCL10具有時(shí)間依賴性。
　　2.DNA受體檢測(cè)結(jié)果顯示：NTHI感染后，BEAS-2B細(xì)胞中cGAS和IFI16的表達(dá)上調(diào)；并且cGAS的表達(dá)與內(nèi)化進(jìn)入胞內(nèi)的NTHI數(shù)量成正比。siRNA特異性敲低cGAS后，會(huì)抑制內(nèi)化NTHI及NTHI-DNA誘導(dǎo)I-IFN的表達(dá)。
　　3.相比于STING野生細(xì)胞(MEFWT)，STING缺陷細(xì)胞(MEFSTING-/-)誘導(dǎo)I-IFN及CXCL10的能力被顯著抑制。與空載

7、組相比較，HEK293T過表達(dá)STING可以促進(jìn)IFN-β的表達(dá)；過表TBK1后IFN-β和CXCL10的表達(dá)也顯著上調(diào)，然而過表達(dá)TBK1(ΔULD)對(duì)IFN-β和CXCL10并無顯著影響。免疫熒光結(jié)果顯示，NTHI-DNA可以誘導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)的p-IRF3表達(dá)上調(diào)；過表達(dá)IRF3能夠上調(diào)NTHI-DNA介導(dǎo)的IFN-β。
　　總結(jié)與討論：
　　胞內(nèi)NTHI-DNA通過STING信號(hào)通路誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生I-IFN和C