抗流感嗜血桿菌外膜蛋白P6單克隆抗體制備及鑒定.pdf

1、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hi）是廣泛存在于健康人呼吸道的條件致病菌，可分為莢膜型和無莢膜型兩類，莢膜型包括a～f共6個(gè)血清型，無莢膜型又稱為不可分型流感嗜血桿菌（nontypeableHaemophilus influenzae，NTHi）。Hi感染十分普遍，可引起腦膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)膿腫等多種疾病，其臨床表現(xiàn)嚴(yán)重而缺乏獨(dú)特性，因此早期、快速的病原學(xué)檢測對Hi感染的診斷和治療都具有非常重要的意義。目前我

2、國臨床實(shí)驗(yàn)室對Hi的檢測以培養(yǎng)法為主，其次有血清學(xué)方法與各種聚合酶鏈反應(yīng)。相比較而言，血清學(xué)方法操作簡便、敏感性高(、)無需特殊儀器，具較高的臨床實(shí)用價(jià)值，但目前所用抗體試劑基本依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴，制約了它的使用。本研究旨在獲得理想的小鼠抗Hi單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，以制備大量高純度的Hi單克隆抗體，為改善Hi抗體試劑依賴進(jìn)口的局面和進(jìn)一步開發(fā)更準(zhǔn)確、快速的血清學(xué)診斷方法而打下基礎(chǔ)。P6蛋白是一種有莢膜和無莢膜的不可分型Hi菌株中均存在

3、的重要外膜蛋白，遺傳上具有高度的保守性，而相對于其它種類細(xì)菌又具有高度的特異性，因此，確定以P6蛋白作為制備單克隆抗體的特定免疫原。實(shí)驗(yàn)過程如下:
　　復(fù)蘇并擴(kuò)增基因工程重組菌BL21(pGEX-6p-2-P6)，按照實(shí)驗(yàn)室確定的表達(dá)條件誘導(dǎo)融合蛋白GST-P6表達(dá)，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析證實(shí)結(jié)果與預(yù)期一致;利用谷胱甘肽微珠對融合標(biāo)簽GST的吸附作用純化重組蛋白，以分光光度計(jì)測定純化液的吸光度

4、，計(jì)算出GST-P6蛋白的含量約為958μg·mL-1。
　　取純化的GST-P6與等體積弗氏完全佐劑充分乳化后腹腔免疫BALB/c小鼠，劑量為每只50μg;以后每隔2周，用相同劑量的免疫原和等體積弗氏不完全佐劑充分乳化后腹腔免疫，連續(xù)2次;間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測小鼠血清抗P6蛋白抗體滴度，有3只小鼠的抗體滴度達(dá)到1∶10000以上;選擇滴度高者腹腔注射同等劑量不含佐劑的重組蛋白加強(qiáng)免疫1次，3d后進(jìn)行融合。

5、>　　按常規(guī)程序留取免疫小鼠血清并制備脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞，加入聚乙二醇(PEG1500)進(jìn)行融合;以經(jīng)甲醛固定的標(biāo)準(zhǔn)Hi菌體和純化重組蛋白GST-P6分別作為檢測抗原，通過方陣實(shí)驗(yàn)確定抗原最佳包被濃度、陽性與陰性血清最佳稀釋度等，建立間接ELISA法用于篩選雜交瘤細(xì)胞;用有限稀釋法對篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，共獲得2株抗P6蛋白單克隆抗體(McAb)細(xì)胞株，分別命名為α2G3和γ2C4.
　　經(jīng)培養(yǎng)上清液檢測，證實(shí)α2

6、G3和γ2C4兩株細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)、多次傳代及凍存復(fù)蘇后均能穩(wěn)定分泌抗P6蛋白單克隆抗體;細(xì)胞培養(yǎng)上清液最高滴度分別為1∶256和1∶512.核型分析顯示雜交瘤細(xì)胞株α2G3的染色體眾數(shù)為103條，γ2C4為95條，特征性的中間著絲粒染色體各為1條，符合融合細(xì)胞的特征。通過細(xì)胞數(shù)量、單抗產(chǎn)量等的觀察，推定α2G3的細(xì)胞周期約為4～5天。
　　以膠體金單克隆抗體試帶鑒定α2G3為IgG2b，γ2C4為IgM，兩者均為Kappa型。間接

7、ELISA檢測表明2種單抗可能識(shí)別P6蛋白不同表位;均只與標(biāo)準(zhǔn)或臨床分離的Hi菌株起反應(yīng)，而與綠膿桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、大腸桿菌等均不反應(yīng)，具有良好的特異性;檢出Hi標(biāo)準(zhǔn)株的最低包被濃度為每孔6.25×103個(gè)細(xì)菌，敏感性也較高。
　　本研究成功地制備了2株可穩(wěn)定產(chǎn)生抗Hi外膜蛋白P6單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，獲得了2種具有良好敏感性與特異性、可結(jié)合不同P6抗原表位的單克隆抗體，為進(jìn)一步研究和開發(fā)更準(zhǔn)確、快捷的Hi臨床檢測方法奠定了基