B型流感嗜血桿菌寡糖綴合物疫苗的免疫活性研究和相關(guān)單克隆抗體的制備.pdf

1、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hi）是一類可以引起嬰幼兒呼吸道感染進(jìn)而會引起繼發(fā)性疾病的病原菌。根據(jù)其有無莢膜，可分為有莢膜型和無莢膜型。無莢膜型細(xì)菌通常引起成人和兒童的局部感染;有莢膜型細(xì)菌可以引起較為嚴(yán)重的侵襲性感染。根據(jù)其細(xì)菌表面莢膜多糖的成分和抗原性的不同，有莢膜型細(xì)菌又可以分為a、b、c、d、e、f六種血清型，不能分型者稱為不定型型。其中，B型流感嗜血桿菌(Hib)的致病力最強(qiáng)，它可以引起敗血癥，

2、并由此引發(fā)腦膜炎、肺炎、會厭炎、蜂窩組織炎、心包炎和中耳炎等。Hib的感染對象主要是5歲以下的小兒，尤其是2歲以下的嬰幼兒。目前，對于Hib感染的主要治療是依靠抗生素。然而，近年來隨著細(xì)菌耐藥性的增加，特別是多重耐藥性菌株的出現(xiàn)，采用疫苗預(yù)防Hib變得十分必要，因此該策略受到越來越多的重視。如今已有多種疫苗用于Hib的預(yù)防并且成效顯著，但它們也存在一定的缺點(diǎn)，譬如價格昂貴且疫苗的質(zhì)量和安全性難以控制等。與此同時，能夠?qū)ib感染進(jìn)行早期

3、檢測，以便給予及時的處理，對于實(shí)施有效的治療、防止Hib的擴(kuò)散及降低由感染引發(fā)的后遺癥都是非常必要和有重要意義的，但是目前還缺乏特別有效的Hib檢測方法。
　　古巴科學(xué)家采用化學(xué)合成的方法制備獲得了Hib細(xì)菌莢膜多糖的寡糖片段，并成功地將其應(yīng)用研制新型的半合成Hib疫苗，證實(shí)具有良好的免疫效果，該疫苗已經(jīng)在臨床上得到廣泛應(yīng)用。這一研究表明了化學(xué)方法制備的具有單一結(jié)構(gòu)、質(zhì)量明確、安全性優(yōu)良的寡糖抗原用于研發(fā)疫苗的可能性。此外，隨著單

4、克隆抗體技術(shù)的不斷成熟及其在各個領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，如今以此技術(shù)為基礎(chǔ)研發(fā)特異、高效的單克隆抗體檢測試劑這一領(lǐng)域得到飛速發(fā)展，這為我們發(fā)展可以實(shí)現(xiàn)Hib感染早期檢測的單克隆抗體試劑盒提供了可能。
　　本課題的終極目標(biāo)是研發(fā)針對Hib的新型糖疫苗，同時研發(fā)可用于Hib細(xì)菌診斷的單克隆抗體。為此，本課題組先后合成了以Hib的細(xì)菌莢膜多糖，即多聚核糖基核糖醇磷酸酯（PRP）的重復(fù)片段為基礎(chǔ)的七(Hept)、九(Nona)和十一(Undeca

5、)聚糖，并將它們與作為載體蛋白的血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶合，形成糖蛋白結(jié)合疫苗Hept-KLH、Nona-KLH和Undeca-KLH。本論文對這些糖蛋白結(jié)合疫苗進(jìn)行了全面的免疫學(xué)評價，并檢測了其抗血清與Hib10211菌株的結(jié)合力。同時，還用這些糖蛋白結(jié)合疫苗免疫小鼠，通過單克隆抗體技術(shù)制各獲得了針對Hib表面莢膜寡聚糖的單克隆抗體，鑒定了該單克隆抗體的亞型，并在體外檢測了單克隆抗體識別

6、和殺傷Hib細(xì)菌的能力。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明，合成的三種糖綴合物中，Nona-KLH的免疫效果較其它兩種糖綴合物強(qiáng)，經(jīng)過四次免疫之后，小鼠產(chǎn)生了很高的抗體滴度，特別是具有保護(hù)作用的IgG1免疫球蛋白，以及T細(xì)胞依賴型的免疫反應(yīng)?？寡迮cHib細(xì)菌的結(jié)合試驗(yàn)顯示，抗血清可以與Hib10211細(xì)菌進(jìn)行特異性結(jié)合。用Nona-KLH對小鼠進(jìn)行免疫后，通過單克隆抗體技術(shù)制備獲得了一種抗原特異性的單克隆抗體，對其進(jìn)行抗體亞型分析以及SDS-P