基于基因免疫抗hCGβ單克隆抗體的制備及其抗腫瘤活性的研究.pdf

1、構(gòu)建hCGD腫瘤基因疫苗的真核表達載體TR421-ehCGβ,可以在小鼠體內(nèi)誘生較強的特異性針對hCGβ的體液免疫反應(yīng),我們發(fā)現(xiàn)由該基因疫苗誘導的多克隆抗hCGβ血清可以在體外以補體非依賴的方式抑制王-IeLa、HepG2等腫瘤細胞的增殖,并且抗hCGβ抗體的抗增殖活性與腫瘤細胞表達hCGβ的高低密切相關(guān)。為了進一步研究抗hCGβ抗體對腫瘤細胞生物學功能的影響,本課題利用TR421-hCGβ通過基因免疫手段免疫小鼠制備抗hCGβ單克隆抗

2、體,鑒定其生物學特性,并從中篩選具有抗腫瘤活性的單克隆抗體,分析其抗瘤效應(yīng),為基于hCGβ的腫瘤生物治療尋找新的途徑。
　　 第一部分 基于基因免疫抗hcGβ單克隆抗體的制備
　　 一、TR421-hCGβ基因免疫小鼠誘導產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答
　　 為制備抗hCGβ單克隆抗體,以TR421-0hCGβ經(jīng)肌肉免疫BALB/c小鼠。采血收集血清,檢測各組小鼠血清中抗hCGβ抗體,結(jié)果顯示:DNA初次免疫后第10天即

3、可檢測出抗hCGβ特異性抗體,追加免疫后抗體的水平顯著增高,特異性IgG滴度達1:104,在初次免疫后第4周再次增強免疫,抗體水平繼續(xù)升高,而且各免疫小鼠的抗體上升水平趨向一致,以上結(jié)果提示TR421-hCGβ基因免疫小鼠可誘生特異性體液免疫應(yīng)答。為下一步成功高效的進行免疫小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞融合奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、特異性分泌抗hCGβ單克隆抗體的雜交瘤細胞株的建立
　　 為獲得特異性分泌抗hCGβ單克隆抗體的雜交

4、瘤細胞,取抗體效價最高的小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合,在8塊96孔板中,共有340孔可見明顯雜交瘤細胞生長,融合率為45％。隨后,對已融合的雜交瘤細胞進一步檢測其是否分泌特異性抗hCGβ抗體,ELISA結(jié)果顯示:1A11、2E9、2G7、2H3、3C2、3F2、4C6、4G7、5C5、5D5、6H1、7A3、7A8、8D4、8F1初步檢測到有特應(yīng)性抗體產(chǎn)生。對篩選陽性孔進行有限稀釋法克隆和上清篩選,經(jīng)過三次亞克隆,共獲得9株分泌特異性

5、抗hCGβ單抗的雜交瘤細胞,分別命名為1A11、2E9、2G7、3C2、5C6、5D5、6H1、7A8和8F1。染色體核型分析顯示所有獲得的雜交瘤細胞株染色體數(shù)目均在90條以上,將雜交瘤細胞經(jīng)體外連續(xù)傳代培養(yǎng),液氮凍存半年后復蘇,仍生長良好,持續(xù)穩(wěn)定分泌抗體,證明9株雜交瘤細胞株已成功建立。
　　 三、抗hCGβ單克隆抗體的基本生物學特性鑒定
　　 為證明所獲得的單克隆抗體可以特異性識別hCGβ分子,用免疫印跡法(Wes

6、ternblot)鑒定抗體與hCGβ分子的特異性結(jié)合,結(jié)果顯示:9株單克隆抗體印染的PVDF膜在hCGβ的位置上出現(xiàn)了特異性的染色條帶,大小為30kD左右,與文獻報道的人hCGβ分子量相符合,證實獲得的單克隆抗體均可以特異性識別真核細胞表達的hCGβ蛋白。應(yīng)用間接免疫熒光證實,9株單克隆抗體可以不同程度識別HeLa細胞、HepG2細胞和HL60細胞上表達的膜型hCGβ分子。同時應(yīng)用間接ELISA確定其亞型,1A11、2E9、5D5和7A

7、8亞型為IgG1,2G7、3C2和6H1亞型為IgG2a,5C6和8目的亞型為IgG2b。
　　 第二部分 具有抗腫瘤活性的抗hCGβ單克隆抗體的篩選
　　 一、具有抗腫瘤細胞增殖活性的抗hCGβ單克隆抗體的篩選
　　 在篩選具有抗腫瘤細胞增殖活性的單克隆抗體之前,我們對本實驗中通過基因免疫獲得的多克隆抗血清進行了功能鑒定。腫瘤細胞體外增殖結(jié)果顯示:TR421-hCGβ質(zhì)粒免疫血清(1:10稀釋)相對于正常血清對

8、HeLa細胞和HepG2細胞增殖有明顯的抑制作用(P<0.05)。滅活補體后的免疫血清對細胞增殖的仍然有較顯著的抑制作用,提示:抗hCGβ多克隆抗體對hCGβ陽性腫瘤細胞具有明顯抑制作用,且該作用不依賴補體。為檢測第一部分中制備的抗hCGβ單克隆抗體是否同樣抑制腫瘤細胞的體外增殖活性,我們通過檢測雜交瘤細胞的培養(yǎng)上對HeLa細胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn):6H1雜交瘤細胞培養(yǎng)上清與HeLa細胞共孵育48小時后,抗體處理組活細胞數(shù)占未處理組細胞數(shù)的

9、81.67±7.63％,提示6H1能夠抑制體外培養(yǎng)的HeLa細胞的增殖。
　　 二、6H1單克隆抗體的制備純化及基本特性鑒定
　　 為進一步對6H1單克隆抗體的抗腫瘤效應(yīng)進行分析,我們采用體內(nèi)法收集小鼠腹水,制備高效價高純度的6H1單克隆抗體,腹水產(chǎn)生的陽性率為80％,收獲量平均5ml/只,腹水抗體效價達1:106。腹水經(jīng)預(yù)處理后經(jīng)Protein G親和層析柱純化,用SDS-PAGE電泳鑒定純度達到90％以上。ELISA

10、鑒定純化6H1單克隆抗體可以特異性的結(jié)合hCG,同時與hLH或FSH無交叉反應(yīng)性。FACS檢測結(jié)果顯示:7株腫瘤細胞表達的膜結(jié)合型hCG可以不同程度的被純化6H1單抗識別并結(jié)合。間接免疫熒光染色進一步證實,6H1單抗能夠特異性的識別HeLa細胞表達的具有天然構(gòu)象的膜型hCGβ分子。
　　 第三部分 6H1單克隆抗體的抗腫瘤作用及其機制
　　 一、6H1在體外抑制腫瘤細胞增殖
　　 為觀察純化的抗hCGβ單克隆抗體

11、6H1對腫瘤細胞增殖活性的影響,選擇天然高表達hCGβ的人HeLa細胞作為靶細胞,檢測純化6H1抗體孵育細胞的增殖活性。結(jié)果證實,6H1與HeLa細胞共孵育后顯示有明顯的細胞毒作用,并且呈劑量依賴性,當6H1以濃度160μg/ml作用時,HeLa細胞生長抑制率達58％。隨著孵育時間的延長,6H1對細胞生長的抑制效應(yīng)也趨明顯,呈時間依賴性。為進一步觀察純化的抗hCGp單克隆抗體6Hl對其他表達hCGβ的腫瘤細胞增殖活性的影響,選擇其他表達

12、hCGβ的人腫瘤細胞系HL-60、K562、HepG2、7721、PC-3以及SKOV-3作為靶細胞,以不表達hCGβ的ECV-304細胞為對照,檢測純化6H1抗體孵育細胞的增殖活性。結(jié)果顯示,除HeLa細胞外,HL-60、HepG2、7721和PC-3不同程度的對6H1單克隆抗體的細胞毒作用敏感,而K562和SKOV-3細胞活度沒有明顯變化。
　　 二、6H1在體內(nèi)抑制腫瘤生長
　　 為進一步驗證6Hl單克隆抗體對He

13、La細胞存在細胞毒作用,我們進行裸鼠體內(nèi)腫瘤攻擊實驗。將裸鼠皮下種植HeLa細胞腫瘤后進行抗體干預(yù),每周測量腫瘤大小及并記錄荷瘤小鼠的生存周期的變化。結(jié)果顯示:荷瘤后第28天,6H1處理組腫瘤平均體積為1.76cm3,分別與對照抗體處理組3.41cm3、PBS處理組3.63cm3相比,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。同時監(jiān)測荷瘤小鼠的生存周期,PBS對照、對照抗體處理小鼠的平均生存期分別為30和37天,而6H1處理組的小鼠直至第48天

14、,仍有100％的存活率,小鼠平均生存期為77天。證明6H1單克隆抗體可以抑制體內(nèi)HeLa細胞的生長。
　　 三、6H1單克隆抗體誘導腫瘤細胞凋亡
　　 為探討6H1單克隆抗體對腫瘤細胞增殖的抑制效應(yīng)的作用機制,相差顯微鏡下觀察6H1孵育48h的HeLa細胞形態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與6H1抗體共孵育的HeLa細胞與對照相比,部分細胞體積變小,表面無光澤,變圓,細胞表面突起多個小球狀的凋亡小體,提示:6H1能誘發(fā)hCGβ陽性腫瘤細胞

15、活力下降甚至凋亡,hCGβ陽性腫瘤細胞增殖活性下降可能與其有關(guān)。Hoechst 33258染色試驗進一步從形態(tài)學上提示:6H1單克隆抗體可以誘導HeLa凋亡。收集6H1作用的HeLa細胞,抽取細胞總DNA進行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示:與正常對照組細胞基因組DNA相比,6H1作用的HeLa細胞DNA呈明顯的ladder,提示有凋亡細胞的存在。對6H1處理的HeLa細胞進行Annexin V/PI雙染,FACS檢測結(jié)果顯示:6H1單克隆抗體

16、作用48小時后,顯示早期凋亡信號(Annexin V+/PI-)的HeLa細胞數(shù)量(9.46％)明顯多于對照抗體組(0.80％),晚期凋亡細胞(Annexin V+/PI+)數(shù)量(4.55％)也明顯多于對照組(0.71％),壞死細胞(Annexin V+/PI+)數(shù)量也較對照組有部分增加。說明6H1單克隆抗體可以通過引起腫瘤細胞凋亡介導其抗腫瘤作用。
　　 綜上所述,本課題基于基因免疫原理,運用經(jīng)典的B細胞雜交瘤技術(shù),獲得了9株

17、持續(xù)穩(wěn)定分泌特異性抗hCGβ單克隆抗體的雜交瘤細胞株,這些單克隆抗體可以特異性結(jié)合腫瘤細胞表達的hCGβ分子。通過對這些單克隆抗體進行生物學功能的篩選,我們發(fā)現(xiàn)6H1單克隆抗體可以在體外抑制HeLa細胞的增殖,通過進一步的實驗證明,6H1對hCGβ陽性的腫瘤細胞株有比較顯著的細胞毒作用,并具有體內(nèi)抑瘤活性。通過對凋亡相關(guān)指標的監(jiān)測,我們證明6H1可以通過誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)揮其體內(nèi)外抗腫瘤效應(yīng)。本研究為今后hCGβ表達陽性的腫瘤的防治提供