miRNA干擾降低信號調(diào)節(jié)蛋白α表達(dá)提高DC疫苗抗腫瘤活性及其單克隆抗體的制備和應(yīng)用.pdf

1、一、miRNA干擾降低信號調(diào)節(jié)蛋白α表達(dá)提高DC疫苗抗腫瘤活性
　　 研究背景和目的:
　　 信號調(diào)節(jié)蛋白a(SIRPα)是SIRP家族中最主要的成員。SIRPα的組織分布主要在髓系(巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞等)，因此SIRPa在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中的作用已被日益重視?？偟膩碚f，在免疫系統(tǒng)中SIRPα通過與特異性配體CD47相互作用發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用。在天然免疫中，LPS可通過轉(zhuǎn)錄抑制和蛋白降解途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中SIRPa表達(dá)下調(diào)，

2、SIRPa通過屏蔽SHP-2作用抑制MAPK、IKKs、NF-κB和IRF3激活，減少炎性因子IL-6、TNFα和IFNβ釋放。但用SIRPα抗體與SIRPα結(jié)合，能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌一氧化氮，這從另一方面說明了SIRPα有可能在天然免疫中起到一定的正向調(diào)節(jié)作用。在SIRPα與獲得性免疫關(guān)系的研究中，利用CD47-Fc段融合蛋白作為配體與DC表面SIRPα相互作用，能觀察到DC表型和功能的抑制，包括DC成熟標(biāo)志減少，細(xì)胞因子IL-12分泌

3、減少。DC表面的SIRPα與T細(xì)胞表面的CD47相互結(jié)合，雙向負(fù)調(diào)節(jié)DC和T細(xì)胞功能：一方面，抑制DC活化，下調(diào)其抗原遞呈能力；另一方面，抑制T細(xì)胞增殖和殺傷功能。由于實(shí)驗(yàn)方法的限制，目前對于SIRPα在獲得性免疫DC中的功能和應(yīng)用研究相對較少，缺乏系統(tǒng)性。
　　 在腫瘤免疫中，獲得性免疫激活起著不可或缺的作用，而樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的專職性抗原遞呈細(xì)胞(antigen-prese

4、nting cells，apc)，能攝取和加工遞呈抗原，具有強(qiáng)大的激活CD8+、CTL及CD4+T輔助細(xì)胞的能力，控制著體內(nèi)獲得性免疫反應(yīng)的過程，在免疫應(yīng)答中處于中心地位，因而成為腫瘤免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。DC可以在體外培養(yǎng)后用于體內(nèi)免疫治療，也可通過骨髓造血干細(xì)胞移植，并輔以細(xì)胞因子或其它因子如flt-3等在體內(nèi)擴(kuò)增。用DC疫苗進(jìn)行腫瘤免疫治療已受到重視，且成為當(dāng)今生物治療領(lǐng)域倍受關(guān)注的熱點(diǎn)課題。利用慢病毒向樹突狀細(xì)胞導(dǎo)入SIRPα的干

5、擾片斷，有助于全面了解SIRPα在獲得性免疫中功能，為SIRPα在獲得性免疫中的應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒：LV-microRNA-SIRPα、LV-GFP、LV-SIRPα；慢病毒包裝和滴度檢測；
　　 2.骨髓來源DC的分離培養(yǎng)；
　　 3.SIRPα對DC活化的影響及機(jī)制：
　　 a)生存能力的改變：(a)PI染色流式細(xì)胞計(jì)數(shù)在無GM-CSF的培養(yǎng)條件下

6、各組DC的生存能力；(b)免疫蛋白共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：P85與SIRPα相互結(jié)合；(c)生存能力相關(guān)PI3K-AKT通路的改變-Western-blot；(e)抑制劑抑制PI3K-AKT通路后，觀察計(jì)數(shù)在無GM-CSF的培養(yǎng)條件下各組DC的生存能力；(d)檢測PI3K磷酸化情況，觀察SIRPα對其影響；(f)構(gòu)建磷酸化位點(diǎn)突變AKT，觀察其對無GM-CSF的培養(yǎng)條件下各組DC的生存能力的影響。
　　 b)成熟和遷移能力的改變：(a)

7、PE標(biāo)記的MHCⅡ、CD80、CD86、CCR7、CCR5流式細(xì)胞計(jì)數(shù)；(b)分泌細(xì)胞因子功能的改變-IL12、IL-6、TNFαELISA檢測；(c)體內(nèi)觀察干擾SIRPα的DC遷移和增殖能力的改變-CFSE標(biāo)記，流式檢測代謝；(d)免疫蛋白共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：SHP2與SIRPα相互結(jié)合；(e)慢病毒介導(dǎo)的SHP2干擾和SHP2-SIRPα雙干擾DC，鑒定IL12、CD80、CD86、CCR7、CCR5的改變，確認(rèn)成熟和遷移能力是否與S

8、HP2相關(guān)；(f)分泌功能相關(guān)JAK-STAT通路的改變-Western-blot；(g)成熟遷移相關(guān)NF-κB通路的改變-Western-blot。
　　 c)對T細(xì)胞的抗原遞呈能力：(a)T細(xì)胞的增殖能力的改變-H3增殖實(shí)驗(yàn)；(b)T細(xì)胞分泌IFN-γ水平的改變-ELISPOT檢測；(c)T細(xì)胞殺傷功能的改變—非放射性乳酸脫氫酶檢測。
　　 4.體內(nèi)觀察干擾SIRPα的DC的腫瘤免疫功能的改變—在治療和預(yù)防模型中應(yīng)用

9、SIRPα干擾的DC疫苗，觀察對腫瘤大小和小鼠生存時間的影響。
　　 結(jié)論:
　　 本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒干擾技術(shù)有效抑制DC中SIRPα的表達(dá)，并通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)SIRPα在DC生存、成熟和抗原遞呈中起著重要的抑制作用。此外，我們還通過小鼠腫瘤模型進(jìn)一步證實(shí)SIRPα在腫瘤免疫中發(fā)揮抑制性調(diào)節(jié)作用。結(jié)果提示：干擾DC中SIRPα制備的DC疫苗有可能成為腫瘤免疫治療中重要的組成部分。
　　 二、人信號調(diào)節(jié)蛋白α單克

10、隆抗體的制備和應(yīng)用
　　 研究背景和目的：
　　 信號調(diào)節(jié)蛋白(signal regulatory proteins，SIRPs)家族是屬于免疫球蛋白超家族的成員(IgSF)。第一個被明確的SIRP家族成員既是大鼠的蛋白酪氨酸磷酸酶SIRPa，也叫SHPS1，CD172a，P84等，是一種主要表達(dá)于髓系細(xì)胞(巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞等)的膜蛋白。
　　 SIRPa在細(xì)胞內(nèi)傳遞信號主要通過胞內(nèi)酪氨酸殘基的磷酸化。其胞外

11、區(qū)的三個Ig樣結(jié)構(gòu)域可被多種有絲分裂原活化而發(fā)生胞內(nèi)區(qū)的磷酸化，如血清、胰島素、生長因子、EGF、PDGF以及神經(jīng)營養(yǎng)因子等。而整合素介導(dǎo)的細(xì)胞與纖粘蛋白和層粘蛋白的粘附也可誘導(dǎo)其磷酸化。絲裂原刺激通過受體型酪氨酸激酶可快速(1-2分鐘)磷酸化SIRPa，而粘附介導(dǎo)的磷酸化需經(jīng)胞漿型酪氨酸激酶的活化發(fā)揮作用，通常需要15-20分鐘。SIRPa被磷酸化后能結(jié)合帶有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白磷酸酶SHP-1和SHP-2使之活化，并作為其底物被去磷酸

12、化。近來發(fā)現(xiàn)SIRPa還可結(jié)合多種接頭蛋白如FyB/SLAP130，SKAP55hom和Grb2，因此被認(rèn)為是支架蛋白參與多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。SIRPa過去被認(rèn)為可以負(fù)性或正性調(diào)節(jié)由生長因子或細(xì)胞黏附引起的MAPKs激活。此外，表達(dá)SIRPa的負(fù)顯性突變體可以激活NF-κB的活性并使細(xì)胞對TNF引起的凋亡耐受。為了進(jìn)一步明確SIRPa在細(xì)胞中負(fù)向調(diào)控作用，并設(shè)計(jì)阻斷其抑制性信號，提高機(jī)體免疫細(xì)胞反應(yīng)性，我們制備并鑒定了人信號調(diào)節(jié)蛋白a

13、的單克隆抗體(mAb)。
　　 SIRPα的胞外區(qū)與特異性配體相結(jié)合，是其實(shí)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的重要途徑。目前對SIRPα的特異性配體研究比較多的是另一種膜蛋白CD47。與SIRPa的嚴(yán)格組織細(xì)胞表達(dá)不同，CD47在大部分細(xì)胞類型都有表達(dá)，因此SIRPα與CD47復(fù)合體在SIRPα介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用，包括介導(dǎo)細(xì)胞吞噬、遷移和細(xì)胞因子分泌等。因此，實(shí)驗(yàn)中我們設(shè)計(jì)合成的多肽針對兩者可能的結(jié)合位點(diǎn)，利用雜交瘤技術(shù)，制備了人SIR

14、Pα抗體；通過鑒定其功能，確定此抗體能很好拮抗SIRPα的信號通路，有效提高免疫細(xì)胞反應(yīng)性。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.制備抗人SIRPa的單克隆抗體：
　　 A、合成作為半抗原的多肽，其序列為：RVTTVSESTKRENMDFSISISC；
　　 B、將上述多肽與鑰孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)，作為免疫原免疫小鼠；
　　 C、取免疫鼠的脾細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合；
　　 D、經(jīng)多輪篩選

15、出與合成多肽反應(yīng)陽性的細(xì)胞克隆，作為抗人SIRPa蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
　　 E、通過在小鼠體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)腹水抗體，將腹水進(jìn)行純化，得到抗人SIRPa的單克隆抗體；或者通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，分離純化，得到抗人SIRPa的單克隆抗體。
　　 2.檢測上述抗人SIRPa的單克隆抗體對SIRPa檢出能力(通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化和Western Blot)。
　　 3.檢測上述抗人SIRPa的單克隆抗體刺