抗CXCR3-B單克隆抗體的制備及其抗腫瘤機制的研究.pdf

1、CXCR3—B分子屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，全長由415個氨基酸構成，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一在NH2端含ELR序列的CXC家族受體。鑒于ELR序列與血管增生密切相關，推斷ELR序列在CXCR3—B分子功能方面具有特殊的意義，因此研究CXCR3—B分子N端51個氨基酸的功能將不僅為CXC家族在血管增生效應方面的研究提供新的思路，而且在解釋PF4及其它CXC家族無ELF序列趨化因子抑制腫瘤增生的作用機理方面也有可能會有重大突破。 本實驗

2、主要制備了鼠/兔抗人CXCR3—B分子N端不同多肽的單/多克隆抗體，并對PF4抑制U937細胞增殖的作用機理進行了初步研究。首先，用化學方法合成CXCR3—B分子N端第1～19個、第17～35個氨基酸和第33～51個氨基酸；同時利用RT—PCR結合PCR克隆CXCR3—B基因，測序正確后，與PGEM—T表達載體鏈接，轉化BL21感受態(tài)細胞進行融合蛋白的表達，取裂解后的GST—CXCR3—B融合蛋白表達菌體的上清用GSTrapFFTM純化

3、柱純化，另取一部分上清用80ul（IU/ul）的Factor Xa剪切；隨后用獲得的人CXCR3—B分子N端1—51個氨基酸多肽融合蛋白免疫Balb/c小鼠，ELISA法檢測抗血清效價及篩選陽性克隆用于細胞融合實驗，以期獲得兔/鼠抗人CXCR3—B分子N端多肽多/單克隆抗體。Western blot與免疫組化鑒定后，通過流式細胞術初步研究抗CXCR3—B抗體在PF4抑制腫瘤轉移方面的作用機制。結果顯示：化學法合成的CXCR3—B分子N端

4、多肽抗原純度分別可達98％、88.54％和80％，可用來作為抗原免疫動物；融合蛋白表達后SDS—PAGE分析顯示，目的蛋白在上清中表達，且Western blot表明抗CXCR3—B抗體可識別GST—CXCR3—B融合蛋白，說明此融合蛋白已獲得正確表達；經(jīng)Factor Xa剪切后Western blot分析發(fā)現(xiàn)剪切下來的CXCR3—B可被抗CXCR3—B的多抗識別，可用于抗CXCR3—B單克隆抗體的篩選。免疫小鼠后篩選出效價高的小鼠進行