新型抗HER2單克隆抗體的抗腫瘤作用及機制研究.pdf

1、人表皮生長因子受體2（Human Epidermal growth factor Receptor2，HER2，也稱為ErbB2）是受體酪氨酸激酶的ErbB受體家族成員。約20％-30％乳腺癌患者的癌組織中有HER2基因的過度表達，HER2過表達的乳腺癌浸潤性強，無病生存期短，預后差。HER2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，它沒有天然配體，在單體狀態(tài)下無活性，當與ErbB家族其他3個成員EGFR、HER3、HER4形成異源二聚體時可使酪

2、氨酸激酶活化，激活MAPK和PI3K/Akt通路，最終導致腫瘤細胞增殖。近年來以HER2為靶點的靶向治療已成為乳腺癌治療研究的熱點。Trastuzumab(Herceptin，曲妥珠單抗，赫賽汀)是由美國Genentech公司開發(fā)的靶向HER2的人源化單克隆抗體，它于1998年獲得美國FDA批準用于HER2高表達轉移性乳腺癌的治療。HER2分子的膜外區(qū)包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個結構域，Trastuzumab與HER2分子的細胞外結構域Ⅳ結合

3、，可阻斷配體非依賴的HER2∶HER3異源二聚體的形成，但不能阻斷配體依賴的HER2∶HER3異源二聚體形成。即使在HER2高表達乳腺癌，Trastuzumab的有效率也僅為30％。Pertuzumab(Omnitarg，帕妥珠單抗)是美國Genentech公司研制的另一株的抗HER2人源化抗體。Pertuzumab可通過結合HER2分子膜外區(qū)的結構域Ⅱ阻斷配體依賴的HER2∶HER3異源二聚體的形成，但不能阻斷配體非依賴的二聚體形成。

4、總的說來，Trastuzumab抑制配體非依賴HER2異源二聚體，而Pertuzumab抑制配體依賴的HER2異源二聚體，它們具有互補的抗腫瘤作用機理。研究表明Trastuzumab和Pertuzumab的聯(lián)合用藥可以有效抑制體內外的腫瘤細胞增殖。2012年6月美國FDA已批準trastuzumab聯(lián)合pertuzumab用于臨床治療HER2過表達轉移性乳腺癌。但雙抗體聯(lián)合治療的療效仍有所不足，其客觀緩解率僅為24％，完全緩解率不足8％

5、。因此，發(fā)展新型HER2靶向治療性抗體或者提供新的抗體組合治療策略顯得迫切重要。
　　本課題首先構建了HER2分子胞外段基因的表達質粒，通過真核轉染純化制備了HER2分子胞外段蛋白，利用其免疫小鼠使并通過雜交瘤技術篩選得到一株全新的抗HER2單克隆抗體7C3，競爭結合實驗表明Trastuzumab和Pertuzumab均不能與7C3競爭結合HER2，提示7C3識別的抗原表位與Trastuzumab或Pertuzumab識別的表位均

6、不相同。我們利用免疫共沉淀實驗對7C3抑制配體依賴的HER2異源二聚化的能力進行了評價。在SK-BR-3和BT-474乳腺癌細胞系中，7C3可以有效抑制EGF刺激的HER2∶EGFR異源二聚化。利用蛋白質印跡法對7C3抑制HER2下游信號通路的能力進行檢測，實驗數據顯示7C3單抗可以顯著降低MAPK磷酸化的水平，但對Akt磷酸化的影響不明顯。細胞增殖抑制實驗表明7C3抗體能夠有效地抑制乳腺癌細胞的體外增殖。為了確定7C3的抗原表位，我們

7、對7C3和HER2膜外區(qū)蛋白進行了共結晶，在3.1埃分辨率下解析了7C3∶HER2復合物晶體結構，結晶數據表明7C3主要與HER2分子的結構域Ⅲ結合，部分殘基與結構域Ⅱ結合，但遠離二聚化臂。重要的是，與游離的HER2分子結構相比，當7C3結合HER2時，HER2的二聚化臂發(fā)生了明顯的構象改變。我們推測:盡管7C3不直接與HER2分子二聚化臂結合，但可以通過與HER2結構域Ⅲ的結合而使HER2分子發(fā)生構象改變，進而阻斷HER2異源二聚化的

8、形成及下游信號通路。
　　綜上所述，本課題發(fā)現(xiàn)了一種新的抗HER2單克隆抗體，與以往所有的HER2抗體不同的是，它能誘導HER2分子發(fā)生構象改變。盡管其不直接與HER2分子二聚化臂結合，仍能有效抑制HER2分子二聚化，繼而阻斷HER2分子下游信號通路，抑制HER2過表達乳腺癌細胞生長。我們的研究結果還進一步闡明了HER2分子結構和功能的關系，為乳腺癌的治療提供了新的HER2靶向抗體制劑。這個新HER2抗體可能與以往的HER2靶向抗