抗HER2人源化單克隆抗體在乳酸克魯維酵母中的表達(dá)及其產(chǎn)物分析.pdf

1、HER2/neu基因是一種原癌基因，位于人染色體17q21，其編碼產(chǎn)物p185erbB2蛋白具有酪氨酸激酶活性，為表皮生長因子受體家族成員之一。當(dāng)HER2/neu基因過度表達(dá)時(shí)，存在于多種腫瘤組織，包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和宮頸癌等均可檢測到該基因?？笻ER2人源化單克隆抗體直接作用于p185erbB2胞外域，因而是一種理想的靶向治療藥物。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明：抗HER2人源化單克隆抗體能抑制過度表達(dá)HER2/neu

2、基因的乳腺癌細(xì)胞生長。 目前，抗體主要采用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，但哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)成本高，使每個(gè)療程的抗體藥物費(fèi)用高達(dá)數(shù)萬美元，難以實(shí)現(xiàn)抗體藥物的廣泛應(yīng)用。乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis，K．．lactis)作為一種較完善的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，不僅具有易于高密度發(fā)酵、外源基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中，可對外源蛋白進(jìn)行糖基化修飾等酵母共有的優(yōu)點(diǎn)外，還具有遺傳背景清楚和表達(dá)系統(tǒng)安全等優(yōu)點(diǎn)。K．．lactis

3、表達(dá)系統(tǒng)已成功表達(dá)多種外源蛋白，但尚未見用于全抗體表達(dá)的研究報(bào)道，因此，本研究擬利用K．．lactis表達(dá)系統(tǒng)，以抗HER2單克隆抗體為模型，研究K．．lactis表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)全抗體的能力，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的分析，為開發(fā)抗體藥物生產(chǎn)新平臺奠定基礎(chǔ)。 本研究主要結(jié)果如下： 1.構(gòu)建了抗HER2人源化單克隆抗體輕、重鏈表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了全抗體在K．．lactis中的表達(dá)。對用于K．．lactis中的信號肽和

4、啟動(dòng)子進(jìn)行初步分析，結(jié)果表明：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子LAC4與MFα信號肽的組合能夠獲得較高的抗體表達(dá)水平，搖瓶表達(dá)水平可達(dá)120±20mg．L-1。 2.表達(dá)產(chǎn)物利用HiTraprProteinAFF親和柱純化，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE、Westernblot分析以及與PNGaseF酶切分析，結(jié)果顯示：K．．lactis表達(dá)的抗HER2人源化單克隆抗體的輕、重鏈能夠協(xié)調(diào)表達(dá)，并且能夠自發(fā)通過分子間二硫鍵正確裝配成完整的抗體分子，且抗