流感嗜血桿菌形成生物被膜與慢性阻塞性肺疾患急性發(fā)作相關(guān)性的研究.pdf

1、[目的]觀察流感嗜血桿菌體外生物被膜的形成，并測(cè)定氟喹諾酮類藥物莫西沙星、加替沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星對(duì)流感嗜血桿菌生物被膜的影響。在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依次建立金黃地鼠肺氣腫模型和慢性阻塞性肺病急性發(fā)作模型，檢測(cè)體內(nèi)生物被膜的形成，并進(jìn)一步觀察莫西沙星對(duì)慢性阻塞性肺病急性發(fā)作動(dòng)物模型體內(nèi)流感嗜血桿菌生物被膜的影響。
　　 [方法](1)從慢性阻塞性肺病急性發(fā)作患者痰液中分離流感嗜血桿菌，采用結(jié)晶紫法和掃描電鏡觀察流感嗜血桿菌體

2、外生物被膜的形成。(2)微量肉湯稀釋法測(cè)定不同藥物對(duì)流感嗜血桿菌的最低抑菌濃度，觀察氟喹諾酮類藥物對(duì)流感嗜血桿菌生物被膜形成和破壞的影響，以及莫西沙星對(duì)生物被膜內(nèi)細(xì)菌的殺菌作用。(3)采用氣管內(nèi)注入彈性蛋白酶法建立金黃地鼠肺氣腫模型，制作流感嗜血桿菌瓊脂小珠，將其注入肺氣腫動(dòng)物肺內(nèi)建立慢性阻塞性肺病急性發(fā)作的動(dòng)物模型，測(cè)定隨時(shí)間延長(zhǎng)肺組織炎癥程度和菌落計(jì)數(shù)的變化，利用掃描電鏡觀察氣道表面生物被膜的形成。(4)氣管內(nèi)注入流感嗜血桿菌建立慢

3、性阻塞性肺病急性發(fā)作動(dòng)物模型，觀察莫西沙星治療后，肺組織病理和氣道表面生物被膜的變化，同時(shí)測(cè)定炎癥因子和菌落計(jì)數(shù)的改變。
　　 [結(jié)果](1)從慢性阻塞性肺病急性發(fā)作患者痰液中分離得到流感嗜血桿菌臨床株可在體外培養(yǎng)24-48小時(shí)形成成熟、致密、典型的生物被膜，不同菌株形成生物被膜的能力有所不同，掃描電鏡可在固相支持物表面見(jiàn)到由大量細(xì)菌和其分泌的胞外粘質(zhì)形成的模樣結(jié)構(gòu)，并可見(jiàn)到粘液絲和孔道結(jié)構(gòu).(2)流感嗜血桿菌對(duì)氟喹諾酮類、阿奇

4、霉素、氨芐西林、頭孢噻肟和利福平敏感，氟喹諾酮藥物可在體外抑制流感嗜血桿菌生物被膜的形成，并有一定的破壞作用；其中莫西沙星隨藥物濃度的升高，生物被膜吸光度值逐漸降低，4mg/L以上濃度的藥物可明顯減輕生物被膜程度；另外莫西沙星對(duì)處于生物被膜內(nèi)的細(xì)菌仍有強(qiáng)大的清除作用，在0.25mg/L以上濃度膜內(nèi)活菌數(shù)明顯減少，細(xì)菌清除作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系.掃描電鏡也證實(shí)莫西沙星可明顯減輕生物被膜的程度。(3)成功建立肺氣腫動(dòng)物模型，病理學(xué)檢查可見(jiàn)到肺泡

5、結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡大小不等，肺泡管、肺泡囊和肺泡明顯擴(kuò)張，肺泡壁變薄，肺泡間隔不同程度的斷裂，肺泡腔融合增大，部分融合成肺大泡，符合全小葉型肺氣腫，與正常組相比，模型組的肺泡數(shù)/視野明顯減少，平均肺泡面積和平均內(nèi)襯間隔明顯增大(P<0.01)。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)氣管注入流感嗜血桿菌構(gòu)建慢性阻塞性肺病急性發(fā)作的動(dòng)物模型，隨時(shí)間延長(zhǎng)，肺氣腫動(dòng)物肺內(nèi)炎癥持續(xù)存在；肺泡灌洗液中活菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與正常動(dòng)物感染相比，感染后1-3周內(nèi)，灌洗液中細(xì)菌數(shù)明顯較

6、高(104.14±0.26 VS.102.47±0.32，P<0.05)：肺組織勻漿活菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，正常動(dòng)物注入細(xì)菌后細(xì)菌數(shù)逐漸減少，3周后沒(méi)有分離到細(xì)菌，而模型動(dòng)物感染后，細(xì)菌得不到清除，1-3周內(nèi)均可分離出較多的細(xì)菌(P<0.05)；掃描電鏡觀察，3周后在氣道表面形成生物被膜樣結(jié)構(gòu)。(4)莫西沙星可有效治療流感嗜血桿菌感染所致的肺氣腫動(dòng)物的急性發(fā)作，鏡下可見(jiàn)到炎癥程度減輕；1周后血漿中炎性因子水平明顯降低(P<0.05)，支氣管肺

7、泡灌洗液中炎性因子水平也有不同程度降低，其中IL-8水平早期就有明顯減少；菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，1周內(nèi)灌洗液中沒(méi)有分離到活菌，肺組織勻漿中活菌數(shù)也明顯下降(P<0.05)，3周后，細(xì)菌數(shù)量均再次恢復(fù)；但掃描電鏡沒(méi)有發(fā)現(xiàn)生物被膜樣結(jié)構(gòu)。此外，莫西沙星對(duì)氣管內(nèi)放置的硅膠管表面形成的生物被膜也有抑制作用，表現(xiàn)為用藥后硅膠管表面分離的細(xì)菌數(shù)較少(P<0.05)，掃描電鏡也發(fā)現(xiàn)在莫西沙星作用下硅膠管表面無(wú)法形成成熟的生物被膜，僅見(jiàn)散在的細(xì)菌粘附于管壁

8、上，個(gè)別有細(xì)菌的散在團(tuán)狀聚集，但尚未融合呈膜狀。
　　 [結(jié)論]從慢性阻塞性肺病急性發(fā)作患者痰中分離的流感嗜血桿菌可在體外形成典型的生物被膜；通過(guò)細(xì)菌感染肺氣腫動(dòng)物模型可建立慢性阻塞性肺病急性發(fā)作的動(dòng)物模型，并且隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)菌數(shù)量仍維持在較高水平，同時(shí)在氣道表面可找到體內(nèi)生物被膜形成的證據(jù)。結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可認(rèn)為下呼吸道流感嗜血桿菌生物被膜的形成與慢性阻塞性肺病的急性發(fā)作密切相關(guān)，是導(dǎo)致感染反復(fù)出現(xiàn)、病情遷延、治療效果不