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文檔簡介
1、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,Spn)和不可分型流感嗜血桿菌(nontypeable Haemophilus inftuenzae,NTHi)是成人下呼吸道感染(包括社區(qū)獲得性肺炎和慢性阻塞性肺病急性發(fā)作)中最常見和最重要的病原體.Spn和NTHi的發(fā)病復雜,疾病的轉歸涉及細菌毒力因子和宿主免疫反應的平衡.各種宿主細胞、受體和信號傳導通路在宿主抵抗Spn和NTHi的過程中起到重要作用.然而呼吸道上皮細胞、
2、肺泡巨噬細胞在上述細菌所致肺部炎癥反應中的作用以及它們與細菌相互作用的分子機制并未得到充分闡明. Toll樣受體(Toll-l1ike receptors,TLRs)是近年發(fā)現的一個受體家族.TLR通過病原相關的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)廣泛且特異性地識別各種病原微生物,激活人體天然免疫,在感染早期發(fā)揮重要作用.在TLR受體家族中,TLR2,4與細菌發(fā)病的
3、關系較為密切.TLR下游的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinascs,MAPKs)通路是調控真核細胞反應的重要信號系統(tǒng),參與了細胞對外界刺激的多種反應,包括細胞生長、死亡、細胞周期、炎癥和應激反應等.我們目前所掌握的關于上述病原菌發(fā)病和肺部宿主免疫反應的資料大多來自于動物模型,體外細胞模型研究以及臨床標本的橫斷面剖析,而對于病原菌在人肺臟組織如何與宿主細胞相互作用以及動態(tài)轉歸,我們所知甚少.考
4、慮到急性肺炎患者的肺組織標本很難獲取,我們從胸科手術的肺組織標本中獲取正常的肺組織,建立Spn和NTHi的肺組織體外急性感染模型(Acute lung infection model,ALIM),作為連接細胞和整體動物模型的橋梁,在組織水平研究肺部疾病的病理生理變化.利用該模型進行組織、分子病理學研究以及功能研究可以展示肺部感染性疾病發(fā)生發(fā)展的連續(xù)橫斷面(snapshot).另外,ALIM模型與COPD慢性持續(xù)性病原感染者的肺組織標本相
5、比較,將有助于我們闡明細菌定植和肺部慢性炎癥持續(xù)存在的可能機制. 第一部分:人肺組織體外急性感染模型的建立 建立 Spn 和 NTHi 的人肺組織體外急性感染模型 (ALIM):從胸科手術標本中切取距腫塊或結節(jié)5cm外的正常肺組織,肺組織塊(1cm<'3>)與不同濃度的Spn和NTHi共孵育4h,24h,48h后,收集上清,并取組織塊置于羥乙基哌嗪乙磺酸.谷氨酸介導的具有保護作用的有機溶劑(HOPE)中固定.組織上清乳
6、酸脫氫酶(LDH)結果提示:Spn和NTHi肺組織感染模型可在體外存活48h以上.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測上清白介素(IL)-8顯示:Spn和NTHi以細菌濃度依賴的方式誘導ALIM炎癥反應.經HOPE溶液處理的肺組織,抽提的RNA完整,無明顯降解,逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)顯示:ALIM中IL-8 mRNA的表達較未予細菌刺激組明顯增高.Immunoblot法可檢測到ALIM組織中βactin蛋白的表達.這提示:HO
7、PE溶液對肺組織的核酸和蛋白質有著良好的保護作用.ALIM,作為連接人體細胞和整體動物模型的橋梁,使我們可以在組織水平研究肺部感染性疾病發(fā)生發(fā)展的連續(xù)橫斷面變化.ALIM和HOPE固定技術的結合為肺部疾病的細胞和分子發(fā)病機制研究提供了一個新的功能研究平臺. 結論: 1.初步建立了Spn和NTHi的人肺組織體外急性感染模型. 2.HOPE-solution對肺組織核酸和蛋白質有很好的保護作用,可用于組織形態(tài)學和分子
8、病理學的研究. 第二部分:肺炎鏈球菌致人肺組織炎癥反應的細胞和分子機制研究 利用人肺組織體外急性Spn感染模型(ASIM)和體外細胞培養(yǎng)研究Spn誘導肺組織炎癥反應的細胞和分子機制.原位雜交(ISH)結果顯示:Spn感染離體肺組織24-4gh后,在80-90﹪的肺泡巨噬細胞和15-30﹪的Ⅱ型肺泡上皮細胞內可檢測到Spn-DNA,而支氣管上皮細胞Spn的感染率極低(<1﹪).用抗生素殺死胞外細菌,取組織勻漿涂抹羊血瓊脂
9、培養(yǎng)板過夜后,可見Spn生長.免疫組化(IHC)結果顯示:與對照組比較,氯膦酸鹽/脂質體(Clodronate/liposomes)作用24h后,肺組織中CD68<'+>肺泡巨噬細胞的數目無明顯減少,但是巨噬細胞中的凋亡蛋白Caspase-3的表達卻明顯增強.同時Spn刺激后,Clodmnate/liposomes處理組上清中的腫瘤壞死因子(TNF)-α較對照組顯著降低.這提示Clodronate/liposomes可以通過誘導肺組織中
10、巨噬細胞的凋亡來下調Spn誘導的炎癥反應,肺泡巨噬細胞在Spn所致人肺組織的炎癥反應中具有重要作用.定量RT-PCR檢測發(fā)現:Spn刺激24h后,ASIM中TLR-2,4 mRNA的表達較未感染的肺組織明顯增高.IHC和Immunoblot均證實:ASIM和細胞感染模型中磷酸化的p38MAPK和ERK MAPK不同程度地表達上調.分別應用功能性TLR-2,4單克隆抗體和p38,ERK MAPK抑制劑阻斷受體和信號通路,觀察它們對Spn誘
11、導的肺組織和細胞炎癥反應的影響.ELISA結果顯示:與阻斷TLR2,4受體和ERKMAPK通路相比,抑制p38 MAPK信號通路可以顯著降低ASIM上清中IL-8,IL-6,FNF-α的水平.利用肺泡巨噬細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549,我們證實p38MAPK是介導Spn所致肺部炎癥反應的重要信號分子. 結論: 1.Spn可能是兼性的胞內菌,肺泡巨噬細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞可能是Spn在肺部主要的宿主細胞. 2.建
12、立了肺泡巨噬細胞失活的體外肺組織模型,該模型可用于研究肺泡巨噬細胞在各種環(huán)境因素誘導的肺部免疫反應中的作用. 3.肺泡巨噬細胞在Spn誘導的肺組織急性炎癥反應中具有重要地位.4.Clodronate/liposomes可能通過Caspase-3途徑誘導肺組織肺泡巨噬細胞的凋亡,進而下調炎癥反應.5.P38 MAPK是介導Spn所誘導的肺組織炎癥反應的關鍵信號分子. 第三部分:不可分型流感嗜血桿菌致人肺組織炎癥反應的細胞和
13、分子機制研究 利用人肺組織體外急性NTHi感染模型(AHIM)和體外細胞培養(yǎng)研究NTHi誘導肺組織炎癥反應的細胞和分子機制.ISH結果顯示:NTHi刺激離體肺組織24h后,在70-85﹪的肺泡巨噬細胞和15-30﹪的Ⅱ型肺泡上皮細胞內可檢測到NTHi-DNA.PCR結果顯示COPD患者肺組織中NTHi感染率達35.7﹪(15/42),ISH法證實肺泡巨噬細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞NTHi的感染率分別為:40-50﹪和35-45﹪.
14、NTHi在肺組織急、慢性感染中靶細胞不同的感染率提示:肺泡上皮細胞可能是NTHi在肺組織長期定植較為合適的宿主細胞.IHC和Immunoblot結果顯示:AHIM和A549細胞感染模型中磷酸化的p3g MAPK和ERK MAPK不同程度地表達上調.電泳遷移率檢測(EMSA)和流式細胞術(FCM)結果顯示:NTHi刺激后,肺組織和A549細胞內核因子NF-κB活性明顯增強,并且抑制p38MAPK通路并不影響細胞核內NF-κB的DNA結合活
15、性.分別用p38 MAPK抑制劑SB2035g0和NF-κB抑制劑PDTC預先阻斷相關分子,可以顯著降低感染NTHi的.A549細胞分泌IL-8因子;而ERK MAPK劑UO126并不能阻斷IL-8因子的分泌.因此,NTHi是通過NF-κB和p38 MAPK依賴的途徑誘導A549細胞生成IL-8. 結論: 1.NTHi可能是兼性的胞內菌.肺泡巨噬細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞可能是NTHi在肺部主要的宿主細胞. 2.肺
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