TLR7在EV71感染過程中的作用及利用毛絲鼠和雪貂建立HBV動(dòng)物模型的探索.pdf

1、本文從以下兩個(gè)部分闡述了TLR7在EV71感染過程中的作用及利用毛絲鼠和雪貂建立HBV動(dòng)物模型的探索。
　　第一部分 TLR7在EV71感染過程中的作用
　　背景:EV71是一種單鏈RNA嗜神經(jīng)性病毒，1969年在美國(guó)一次被鑒定出來，但其致病機(jī)制至今未明確。它是引起手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)的常見病毒，一般癥狀比較輕微，但偶爾會(huì)引起非常嚴(yán)重疾病，如無菌性腦膜炎，新生兒致死性腦

2、炎等。自1997年第一次在馬來西亞爆發(fā)致使41名兒童死亡至今已引起包括中國(guó)、新加坡、澳大利亞、越南和柬埔寨等亞洲-太平洋等國(guó)的大規(guī)模流行，并造成了嚴(yán)重后果。目前并沒有有效的臨床治療方案應(yīng)對(duì)，雖然有兩種疫苗上市，但其預(yù)防效果并沒有經(jīng)歷實(shí)戰(zhàn)考驗(yàn)。Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)可以激活抗病毒免疫反應(yīng)，其中TLR7的激活可以誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，包括Ⅰ型干擾素(IFNs)，起到抗病毒的作用。
　　方法:建立

3、EV71感染的小鼠模型，給予TLR7激動(dòng)劑(GS-9620)，進(jìn)行生存率和臨床癥狀的比較。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出最佳給藥劑量和方式，在明顯提高感染小鼠生存率和緩解臨床癥狀的前提下，H&E和熒光免疫對(duì)感染小鼠和感染給藥小鼠進(jìn)行檢測(cè)，利用CBA、real-time PCR、對(duì)正常組小鼠，感染小鼠，感染后給藥組小鼠和單獨(dú)給藥組小鼠3天的血清中細(xì)胞因子/趨化因子、NF-κB和PI3K相關(guān)基因和細(xì)胞因子/趨化因子的相關(guān)基因的表達(dá)。之后進(jìn)行NF-κB和PI3K

4、的作用對(duì)其關(guān)鍵蛋白NF-κB和PI3K進(jìn)行抑制和/或激活，分組為:正常組，感染組，給藥組，PI3K和NF-κB抑制劑組，PI3K抑制劑組;PI3K抑制劑加NF-κB激動(dòng)劑組，NF-κB抑制劑組，NF-κB抑制劑組加PI3K激動(dòng)劑組;對(duì)這8組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行生存率和臨床癥狀的觀察和分析;在得出有明顯差異的情況前提下，進(jìn)行感染、給藥72小時(shí)，利用real-timePCR和H&E染色方法，檢測(cè)肌肉中病毒載量、兩條信號(hào)通路下游的免疫因子的表達(dá)情況和

5、肌肉組織的病理?yè)p傷情況。IFN-AR敲除小鼠感染EV71，觀察死亡率與病毒載量。
　　結(jié)果:MP10為EV71的小鼠適應(yīng)株，腹腔感染10日齡的ICR小鼠100μl(109TCID50/ml)的過半數(shù)致死率，在感染2、26和50小時(shí)，給予TLR7激動(dòng)劑（GS-9620）4.5mg/kg能明顯的提高感染小鼠的生存率和臨床癥狀。利用CBA對(duì)四組小鼠進(jìn)行血液細(xì)胞因子/趨化因子的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TLR7激動(dòng)劑(GS-9620)能夠激活免疫反應(yīng)，增

6、加血液中的IL-1β，IL-5，IL-6，IL-12， IFN-α，IFN-β，IFN-γ， TNF-α，MIP-1α和MCP-1的表達(dá)量。為了進(jìn)一步研究TLR7激動(dòng)劑(GS-9620)是通過激活機(jī)體的免疫反應(yīng)抑制EV71病毒的復(fù)制，從而減輕EV71對(duì)于機(jī)體的炎癥反應(yīng)，研究顯示TLR7激動(dòng)劑是通過激活NF-κB和PI3K產(chǎn)生免疫反應(yīng)，利用PI3K和NF-κB的激動(dòng)劑和/或抑制劑進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)同時(shí)給予PBK和NF-κB抑制劑，感染小鼠在兩

7、天內(nèi)全部死亡，說明PI3K和NF-κB兩條信號(hào)通路在EV71感染過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。抑制PI3K和NF-κB任何一個(gè)蛋白，都會(huì)減弱TLR7激動(dòng)劑(GS-9620)的抗病毒和減輕病理?yè)p傷的作用。IFN-AR敲除的小鼠感染EV71后，促進(jìn)病毒復(fù)制，增加小鼠死亡率。
　　結(jié)論:TLR7通過激活PI3K和NF-κB信號(hào)通路，從而使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，增加相關(guān)細(xì)胞因子/趨化因子的分泌，抑制病毒的復(fù)制和病理?yè)p傷。
　　第二部分 利

8、用毛絲鼠和雪貂建立HBV動(dòng)物模型的探索
　　背景:乙型肝炎病毒(Heptitis BVirus，HBV)感染是全球主要的公共健康問題。血清學(xué)證據(jù)顯示，全球大約有30％的人現(xiàn)在或過去感染過HBV，且有2.4億人為HBV慢性感染者，其中15％-40％很有可能發(fā)展成為嚴(yán)重的肝臟疾病，如:肝硬化和肝細(xì)胞肝癌。機(jī)體感染HBV后，在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，分泌病毒顆粒可長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年，給患者個(gè)人生活和家庭造成了極大的痛苦，同時(shí)也給社會(huì)帶來了嚴(yán)重的公共健康問

9、題。目前臨床治療中，尚無根除HBV感染的有效藥物。由于HBV感染種屬的局限性，除能感染人以外，目前研究顯示，HBV尚可感染黑猩猩和樹鼩，但是其限制性、局限性等因素，使其作為HBV動(dòng)物模型的前景仍不樂觀，阻礙其機(jī)制研究。所以建立新型的、易于飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)操作的、基因明確的HBV動(dòng)物模型，迫在眉睫。
　　方法:嘗試?yán)妹z鼠和雪貂感染乙肝患者含有HBV的血清，進(jìn)行HBV動(dòng)物模型的建立。利用HBV質(zhì)粒設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行real-time P

10、CR確定帶有HBV血清的病毒拷貝數(shù)。后肢靜脈注射感染成年毛絲鼠、皮下注射3日齡毛絲鼠和3日齡雪貂。血清學(xué)進(jìn)行HBV DNA檢測(cè)和HBsAg、 HBsAb和肝功能的檢測(cè);對(duì)肝臟組織進(jìn)行HBV cccDNA的檢測(cè)、H&E病理檢測(cè)，免疫組化檢測(cè)HBsAg抗原。
　　結(jié)果:雪貂觀察6個(gè)月，未在血液中檢測(cè)出HBV DNA;血清中HBsAb抗體陽(yáng)性;幼年毛絲鼠和成年毛絲鼠在每個(gè)月的血清學(xué)HBV DNA檢測(cè)中，均有一定比例只數(shù)檢測(cè)到HBV DN