小鼠配對免疫球蛋白樣受體及其介導的T細胞階聯(lián)與樹突狀細胞免疫耐受作用關(guān)系的研究.pdf

1、移植物抗宿主病(GVHD)仍然是臨床骨髓移植治愈血液系統(tǒng)惡性疾病的主要障礙之一。供者異基因淋巴細胞的異常活化是GVHD發(fā)生、發(fā)展的重要因素，誘導受者產(chǎn)生針對供者異基因主要組織相容性抗原(MHC)特異性耐受是預防GVHD、保存GVL的最佳途徑。配對免疫球蛋白樣受體(Paired immunoglobin-like receptor，PIR)是近年發(fā)現(xiàn)的主要表達在小鼠樹突狀細胞(DCs)上的免疫抑制性調(diào)節(jié)受體，包括免疫抑制性受體(PIR-B

2、)及免疫活化性受體(PIR-A)，其配體均是MHC-Ⅰ，二者與其配體的結(jié)合的水平是決定DCs免疫活化程度的重要分子標志之一。由于DC不僅是調(diào)控體內(nèi)T細胞活化的關(guān)鍵，也是誘導免疫耐受的理想的靶細胞，可以直接或間接通過誘導供者抗原特異性調(diào)節(jié)性T細胞的生成、在體內(nèi)形成T細胞階聯(lián)效應而抑制異基因T淋巴細胞的活化，因此研究PIR在樹突狀細胞的表達、T細胞階聯(lián)的關(guān)系及與免疫耐受的關(guān)系，可能為誘導供者MHC特異性耐受，實現(xiàn)GVHD及GVL的分離提供新

3、的途徑。
　　 第一部分
　　 目的：配對的免疫球蛋白樣受體A、B(paired immunoglobulin-like receptor A、B，PIR-A、PIR-B)屬于小鼠免疫球蛋白超家族成員。研究配對免疫球蛋白樣受體PIR-A、B在小鼠DCs上的表達及與表面共刺激分子變化的關(guān)系，探討PIR與免疫耐受的關(guān)系，探索誘導耐受性DCs的有效途徑。
　　 方法：以C57BL/6小鼠來源DC系DC2.4細胞為研究對

4、象，分別以重組小鼠白介素-10(recombinant mouse interleukin-10，rmIL-10)、重組人轉(zhuǎn)化生長因子β1 (recombinant human transforming growth factorβ1，rhTGF-β1)誘導DC2.4細胞為耐受性DC(tolerogenic DC，T-DC)，脂多糖(LPS)刺激48h為成熟DC2.4細胞(LPS-DC)，體外化學合成特異PIR-B小RNA干擾片段(sm

5、all interfering RNA，siRNA)，以Lip2000轉(zhuǎn)染DC2.4細胞(Si-DC)。分別應用半定量RT-PCR、流式細胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)及Western blot檢測IL-10、TGF-β1、LPS及小干擾RNA對DC2.4細胞上PIR-A/B表達的影響；檢測LPS刺激Si-DCs后表面共刺激分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ及PIR-A的變化；以2-△△Ct表示各目的基因cDNA轉(zhuǎn)錄的相對

6、表達量。分別以上述各組DCs細胞為刺激細胞，以異基因BALB/c小鼠脾淋巴細胞為反應細胞，應用3H-TdR標記法檢測同種異體淋巴細胞的增殖能力(MLR)，ELISA方法測MLR上清中IFN-γ的分泌水平變化。
　　 結(jié)果：FCM檢測DC2.4細胞上PIR-A、PIR-B的共同的胞外區(qū)PIR表達的陽性率為(28.65±8.12)[％]，IL-10、TGF-β1及LPS誘導后PIR表達均上調(diào)(P<0.05)，分別為(54.21±6.

7、34)[％]，(58.78±4.70)[％]，(48.24±6.75)[％]，但IL-10、TGF-β1及LPS各組間無顯著性差別(P>0.05)。半定量RT-PCR及Western blot顯示，IL-10、TGF-β1誘導DC2.4細胞后PIR-B的mRNA及蛋白表達升高，而PIR-A表達則降低，而LPS刺激時則相反，PIR-A的mRNA及蛋白表達升高、PIR-B的表達則降低。流式細胞儀檢測SiRNA陽性對照組的轉(zhuǎn)染率為93.12[

8、％]，SYBR greenⅠRealtime-PCR檢測，LPS刺激后Si-DCs CD80、CD86、MHC-Ⅱ及PIR-A的表達高于正常DCs組。LPS-DCs組CD80、CD86、MHC-Ⅱ及PIR-A的2-△△Ct分別為5.02±1.09、4.69±1.75、5.46±1.79、6.02±2.13；LPS刺激后Si-DC組TAI分別為8.79±2.2、11.03±1.96、10.26±2.55、12.10±2.83，同LPS刺激

9、的正常組相比，Si-DC組分別增加了3.72、6.34、4.8、6.08倍(P<0.05)。混合淋巴細胞反應顯示：正常DC2.4細胞可刺激異基因淋巴細胞反應，IL-10、TGFβ1誘導的T-DC組MLR明顯受抑(P<0.05)，MLR上清中IFN-γ水平也相應降低(P<0.05)。LPS-DC及Si-DCs組MLR明顯增強(P<0.05)，MLR上清中IFN-γ水平明顯增高(P<0.05)；
　　 結(jié)論：上調(diào)免疫抑制性受體PIR

10、-B、下調(diào)活化性受體PIR-A是小鼠DCs獲得耐受的普遍表型特征及分子生物學機制，沉默PIR-B的表達可使PIR-A及CD80、CD86、MHC--Ⅱ及PIR-A過表達，使DCs活化的機制，PIR-A和PIR-B構(gòu)成了小鼠樹突狀細胞耐受的新靶點。
　　 第二部分
　　 目的：研究配對免疫球蛋白樣受體B在樹突狀細胞上表達與調(diào)節(jié)性T細胞的生成的關(guān)系，探討耐受性DCs誘導耐受的詳細機制，為體內(nèi)誘導耐受性DCs及調(diào)節(jié)性T細胞(T

11、reg)生成提供實驗依據(jù)。
　　 方法：免疫磁珠分選BALB/c小鼠CD4+T脾淋巴細胞。以rmIL-10(50ng/ml)、rhTGF-β1(50ng/ml)聯(lián)合誘導C57BL/6小鼠來源的DC2.4細胞3天生成耐受性DCs(T-DC)，同時設正常DC2.4細胞(DC)及LPS刺激48h后成熟的DC2.4細胞(mDC)干擾PIR-B組(Si-DCs)為對照組，各組DCs分別與BALB/c小鼠CD4+T脾淋巴細胞混合培養(yǎng)48h，

12、檢測Treg生成。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA的表達變化，流式細胞儀檢測CD4+CD25+Treg細胞的比例，PI檢測CD4+T細胞的凋亡。磁珠分選的CD4+CD25+Treg與CD4+T細胞按照不同的比例加入MLR體系中，3H檢測Treg對異基因DCs刺激的同基因淋巴細胞的增殖能力影響。
　　 結(jié)果：磁珠分選BALB/c小鼠脾CD4+T及CD4+CD25+T淋巴細胞純度>95[％]，正常DCs、T-DCs、Si-

13、DC及mDCs各組細胞同BALB/c小鼠脾細胞CD4+T細胞混合培養(yǎng)3天，RT-PCR檢測表明，T-DCs組誘導后CD4+T細胞Foxp3mRNA表達明顯高于正常DCs、LPS-DC及Si-DC組。
　　 結(jié)論：誘導Treg細胞生成、促進異基因淋巴細胞凋亡是PIR-B介導性DCs耐受的分子機制，為臨床應用耐受性DCs誘導免疫耐受提供理論依據(jù)，也為Treg的誘導提供新的途徑。
　　 第三部分
　　 目的：誘導宿主產(chǎn)

14、生供者主要組織相容性抗原的特異性耐受是臨床骨髓移植的最終目標，CD8+CD28-T(Ts)細胞是具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T 細胞亞群之一，體外誘導異基因抗原特異性Ts生成，以研究Ts細胞與小鼠樹突狀細胞(DCs)上配對免疫球蛋白樣受體A和B表達的關(guān)系，探討其誘導免疫耐受的分子機制及特點，為臨床抗原特異性免疫治療的誘導提供理論基礎。
　　 方法：體外誘導Ⅰ類主要組織相容性抗原(H-2b)抗原特異性Ts細胞群，以C57BL/6小鼠(

15、H-2b)骨髓來源的樹突狀細胞系DC2.4細胞為刺激細胞，同BALB/c小鼠(H-2d)脾淋巴細胞混合培養(yǎng)，連續(xù)兩次，每次培養(yǎng)7天，第10天于培養(yǎng)體系中加入IL-2(10u/ml)，第14天結(jié)束培養(yǎng)。以生物素標記的CD28、CD8標記上述細胞群，以鏈親和素標記的免疫磁珠分兩步分選Ts細胞，首先負選CD8+T細胞，再正選CD28+T細胞，陰選細胞懸液為Ts細胞群。Ts同C57BL/6小鼠DC2.4(H-2b)細胞混合培養(yǎng)48h，RT-PC

16、R檢測DCs細胞PIR-A、PIR-BmRNA的表達，Westernblot檢測DCs細胞PIR-A、B的表達。3H標記檢測混合淋巴細胞增殖反應(MLR)，體外誘導培養(yǎng)KM鼠骨髓來源的樹突狀細胞，分別以DC2.4(H-2b)及第三者主要組織相容性抗原無關(guān)的KM供鼠DCs細胞為刺激細胞，以BALB/c小鼠來源的脾CD4+T淋巴細胞為反應細胞，加入Ts細胞，以CPM檢測異基因淋巴細胞增殖反應能力。
　　 結(jié)果：體外以C57BL/6小

17、鼠DCs誘導并在體外應用免疫磁珠分選的CD8+、CD8+CD28-Ts＞90[％]，以BALB/c小鼠Ts細胞(H-2d)與異基因C57BL/6小鼠DCs細胞(H-2b)混合培養(yǎng)48h后，RT-PCR及Western blot檢測PIR-BmRNA及蛋白表達上調(diào)、PIR-A的mRNA及蛋白表達則下調(diào)。
　　 結(jié)論：體外誘導的Ts呈現(xiàn)Ⅰ類主要組織相容性抗原特異性抑制異基因反應性淋巴細胞的增殖。其機制與Ts細胞上調(diào)PIR-B mR