卵形鯧鲹TLR7亞家族及其信號通路相關基因的克隆與免疫應答分析.pdf

1、TLR7亞家族由TLR7、TLR8和TLR9組成，分布于細胞內涵體，為I型跨膜蛋白，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)。胞外區(qū)LRRs負責識別病原相關分子模式(PAMPs)，胞內區(qū)TIR結構域可募集接頭分子MyD88或TRIF，激活IRAK-4，活化IRF和NF-κB，誘導表達IFNs和促炎性細胞因子，從而啟動先天性免疫和獲得性免疫，抵御病原入侵。
　　卵形鯧鲹是我國南方地區(qū)一種重要的海水養(yǎng)殖魚類，鱸形目鲹科的一種。近年來，隨著高密度養(yǎng)殖

2、的發(fā)展，由細菌或病毒感染引起的相關疾病頻繁發(fā)生，導致魚類大量死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經濟損失。因此，開展卵形鯧鲹免疫相關分子的克隆與免疫應答研究，具有重要的理論與現實意義。本研究克隆了卵形鯧鲹TLR7亞家族及其信號通路相關基因的全長cDNA，應用生物信息學軟件分析蛋白質的結構和功能，采用qPCR檢測上述各基因在健康魚體組織中的表達，并分析用溶藻弧菌和PolyI:C刺激后上述基因在脾臟和頭腎組織中的表達變化。主要研究結果如下:
　　

3、1、卵形鯧鲹TLR7(TrTLR7)、TrTLR8和TrTLR9全長cDNA分別為4185bp、3432bp和3756bp，5'UTR分別為99bp、93bp和66bp;3' UTR分別為945bp、267bp和519bp; ORF分別為3141bp、3072bp和3171bp，分別編碼1046、1023和1056個氨基酸殘基。預測蛋白序列均存在胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)，其中胞外區(qū)分別存在16、15和17個LRRs;胞內區(qū)均具有1個保守的

4、TIR結構域。TrTLR7、TrTLR8和TrTLR9均與其它魚類相應的蛋白同源性較高，分別為66.2％-80.4％、53.3％-76.3％和53.2％-77.6％。在NJ法構建的進化樹上TrTLR7、TrTLR8和TrTLR9分別與其它魚類聚為一支，表明它們的遺傳關系親近。
　　2、TrMyD88、TrIRAK4、TrIRF3和TrIRF7全長cDNA分別為1213bp、1606bp、1611bp和2083bp;5' UTR分別

5、為63bp、62bp、64bp和69bp;3'UTR分別為283bp、134bp、104bp和691bp; ORF分別為867bp、1410bp、1431bp和1323bp，分別編碼288、469、476和440個氨基酸殘基。TrMyD88存在DD和TIR結構域;TrIRAK4具有DD和S-TKc結構域;TrIRF3和TrIRF7均具有IRF結構域和IRF-3結構域。TrMyD88、TrIRAK4、TrIRF3和TrIRF7均與其它魚類

6、相應的蛋白同源性較高，同源性分別為69.6％-84.7％、49.5％-77.3％、42.8％-82.4％和52.0％-81.7％，在NJ法構建的進化樹上TrMyD88、TrIRAK4、TrIRF3和TrIRF7分別與其它魚類聚為一支，表明它們的遺傳關系親近。
　　3、qPCR檢測結果顯示，TrTLR7亞家族及其信號通路相關基因在健康魚體組織中呈組成型表達。TrTLR7亞家族各成員在脾臟中表達最高，其次為鰓和腎臟等組織，TrTLR7

7、和TrTLR8在腸中表達量最低，TrTLR9在肌肉中的表達量最低;TrMyD88在脾臟中表達最高，其次為肝臟和鰓等組織，肌肉中表達量最低;TrIRAK4在皮膚中表達量最高，其次為脾臟、和肝臟等組織，腸組織中表達量最低;TrIRF3和TrIRF7均在脾臟和肝臟等組織中表達較高，腸組織中表達量最低。
　　4、卵形鯧鲹經溶藻弧菌刺激后，TrTLR7、TrTLR8、TrIRF3和TrIRF7的mRNA在頭腎和脾臟中的表達上調，但不顯著;T